A CB1 és CB2 kannabinoid receptorok expressziójának klinikai jelentősége humán rosszindulatú és jóindulatú pajzsmirigy elváltozásokban

Abstract

Az endokannabinoid rendszer kannabinoid receptorokból (CB1 és CB2) áll, endogén ligandjaik (endokannabinoidok) és az anyagcseréjükért felelős fehérjék számos különböző, a homeosztatikus szabályozáshoz nélkülözhetetlen funkcióban vesznek részt számos szövetben, és tumorellenes hatást is kifejtenek. Jelen vizsgálat célja a CB1 és CB2 expresszió klinikai jelentőségének értékelése volt humán benignus és malignus pajzsmirigy elváltozásokban. A CB1 és CB2 fehérjék expresszióját immunhisztokémiai úton vizsgáltuk 87 benignus és malignus elváltozásban szenvedő betegből nyert paraffinba ágyazott pajzsmirigyszöveteken, és statisztikailag elemeztük a klinikopatológiai paraméterekkel, a follikuláris sejtek proliferációs képességével és az American Thyroid Association (ATA) stádiumbeosztási rendszere szerint becsült kiújulási rátával együtt. A CB1 és CB2 fokozott expressziója szignifikánsan gyakrabban volt megfigyelhető a malignus pajzsmirigy-elváltozásokban, mint a jóindulatúakban ( és , illetve ). A CB1 és CB2 fokozott expressziója szintén szignifikánsan gyakrabban volt megfigyelhető a papilláris karcinómákban, mint a hyperplasztikus csomókban ( és , illetve ). A rosszindulatú pajzsmirigyelváltozásokban az emelkedett CB2-expresszió szignifikánsan összefüggött a nyirokcsomó-metasztázisok jelenlétével . A CB2 fokozott expressziója szintén gyakrabban volt megfigyelhető a kapszuláris , nyirok- és érinvázióval rendelkező malignus pajzsmirigy esetekben, valamint azokban, amelyeknél a kiújulási arány kockázata megnövekedett , bár nem szignifikáns szinten, míg a CB1 expressziója nem volt kapcsolatban a vizsgált klinikopatológiai paraméterek egyikével sem. Adataink arra utalnak, hogy a CB-receptorok részt vehetnek a pajzsmirigy rosszindulatú átalakulásában, és különösen a CB2-receptor hasznos biomarkerként és potenciális terápiás célpontként szolgálhat a pajzsmirigy neopláziában.

1. Bevezetés

Az endokannabinoid rendszer (ECS) egy endogén lipid jeleket kiváltó rendszer, amely számos emberi szövetben jelen van, és számos különböző és egymástól független funkciót fejt ki. Jelentős tanulmányok jelezték az ECS szabályozó hatásait a központi és perifériás idegrendszerre, a gasztrointesztinális traktusra és az immunrendszerre, mivel számos folyamatban, például a gasztrointesztinális motilitásban, a hangulatban, a fájdalom szabályozásában, a memóriában és az étvágyban vesz részt . Ezeket a funkciókat az endogén és exogén ligandumok kannabinoid receptorokhoz (CB receptorokhoz) való kötődése váltja ki. E jól ismert funkciók mellett az ECS számos jelátviteli útvonal modulációján keresztül antiproliferatív hatást is kifejt , míg aktivációja prognosztikai jelentőséggel bírhat a tumorok fejlődési progressziójában .

A CB receptoroknak két altípusa létezik, amelyek eltérő eloszlással rendelkeznek az emberi szövetekben. A CB1 receptor főként a központi idegrendszerben, a zsírsejtekben, a májban, a hasnyálmirigyben, a vázizomzatban és a T-limfocitákban található . A CB2 receptor elsősorban az immunsejtekben észlelhető, de a neuronokban és a központi idegrendszert alkotó más sejtekben is, mint például az asztrociták és a mikroglia, valamint az agyi érrendszeri endotélsejtekben . A CB receptorok aktiválása gátolja a cAMP képződését a Gi fehérjékhez való kapcsolódáson keresztül, ami a protein kináz A- (PKA-) függő foszforiláció csökkenését eredményezi . A CB-receptorok az extracelluláris jel-szabályozott kinázhoz (ERK) és specifikusan a p42/p44 és a p38-hoz is kapcsolódnak , részt vesznek a foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K) és a ceramid jelátvitelben . Más receptorok is kapcsolódnak az ECS-hez, mint a tranziens receptor potenciális kationcsatorna V. alcsalád 1. tagja (TRPV-1), a peroxiszóma proliferátor aktivált receptorok (PPAR) és a nem CB1/CB2 G-fehérje kapcsolt receptorok GPR55 .

Az ECS ligandumok a kannabinoidok, beleértve a Cannabis Sativa bioaktív összetevőit, szintetikus CB-mimetikus vegyületek és a CB receptorok endogén ligandumai . Az első kategória legfontosabb molekulája a Δ9-THC, amely jól ismert pszichoaktív tulajdonságairól . A másik két kategóriába tartoznak a jelenleg kifejlesztett szintetikus ligandumok (CP55940, HU-210, HU-211, ab-kannabidiol, ajuleminsav, WIN55,212-2) és az emberi szervezet által termelt endokannabinoidok, amelyek az arachidonsav (AA) etanolaminnal vagy glicerinnel konjugált lipidhordozó származékai . E molekulák közül a legfontosabbak az anandamid (AEA) és a 2-arachidonoil-glicerin (2-AG), de további anyagokat is azonosítottak, mint például az O-arachidonoylethanolamin (OAE, virodhamin), a 2-arachidonoil-glicerinéter (2-AGE, noladinéter), az N-arachidonoyldopamin (NADA) és a palmitoylethanolamid (PEA) . A CB-receptorokon és valamennyi ligandumukon kívül az ECS magában foglalja a ligandumok bioszintéziséhez, szállításához és lebontásához szükséges enzimeket is .

A homeosztázis fenntartását szolgáló ECS-funkciók mellett a közelmúltban az ECS és a legfontosabb onkogén útvonalak (MAPK/ERK és PI3K/Akt útvonal) közötti fent említett keresztbeszélgetés is érdeklődésre tartott számot, és rávilágított az ECS jelentőségére a tumorigenezisben . Továbbá kimutatták, hogy a kannabinoidok apoptózist indukálnak a rákos sejtekben, gátolják a tumor vaszkularizációját a VEGF csökkenésén keresztül, és elnyomják a rákos sejtek invazív képességét . Antiproliferatív hatások érvényesülnek, és számos tanulmány arra utal, hogy a kannabinoidok potenciálisan tumorellenes szerek .

A pajzsmirigy elváltozások diagnosztizálása az utóbbi időben megnőtt, nemcsak a jobb diagnosztikai technikák miatt, hanem azért is, mert valódi előfordulási gyakoriságuk emelkedik a lakosság körében . Valójában a pajzsmirigy karcinóma az endokrin rendszer leggyakoribb rosszindulatú daganata . Bár a pajzsmirigyrák műtéttel és terápiával általában teljesen gyógyítható, a betegek 10-20%-a mégis meghal a kiújulás vagy a tumor progressziója miatt . Ezért fontos új kezelési stratégiákat kidolgozni és új prognosztikai markereket találni annak érdekében, hogy megjósolható legyen az egyes betegek klinikai lefolyása, és ennek megfelelően testre lehessen szabni a rendelkezésre álló terápiás módszereket. Ebből a szempontból a jelen tanulmány célja a CB1 és CB2 receptor immunhisztokémiai expressziójának értékelése volt a jóindulatú és rosszindulatú pajzsmirigy elváltozásokban, a prognózissal kapcsolatos klinikopatológiai jellemzőkkel összefüggésben.

2. Betegek és módszerek

2.1. Betegek

A vizsgált anyag 87, azonos számú, jó- és rosszindulatú elváltozás miatt pajzsmirigyműtéten átesett beteg szövettanilag vizsgált pajzsmirigyműtéti mintájából állt. Negyvenhárom jóindulatú (37 hyperplasztikus góc és 6 Hashimoto thyreoiditis) és negyvennégy rosszindulatú (40 papilláris és 4 follikuláris karcinóma) esetet vontak be a vizsgálatba. Minden daganatot a WHO pajzsmirigydaganatok szövettani osztályozása szerint osztályoztunk. A kiújulás kockázatát az Amerikai Pajzsmirigy Társaság (ATA) stádiumbeosztási rendszere szerint becsülték meg. A betegek egyike sem részesült a műtétet megelőzően semmiféle rákellenes kezelésben, és a klinikai anamnézisben nem szerepelt fej-nyaki besugárzás vagy más daganatos megbetegedés.

2.2 . Immunhisztokémia

A CB1 és CB2 immunfestését formalinban rögzített, paraffinba ágyazott pajzsmirigyszöveti metszeteken végeztük kecske poliklonális CB1 IgG antitest (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) és nyúl poliklonális CB2 IgG antitest (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology) használatával. Röviden, 4 μm vastag szöveti metszeteket viaszmentesítettünk xilolban, majd fokozatos alkoholokon keresztül vízre hoztuk. Az antigén-visszanyerést 10 mM citrát pufferben (pH 6,1) 15 percig (min) nagy teljesítményen történő mikrohullámú sütéssel végeztük a tárgylemezeken a gyártó utasításai szerint. Az endogén peroxidáz-aktivitás eltávolítása érdekében a metszeteket ezután frissen készített 0,3%-os hidrogén-peroxiddal kezeltük metanolban, sötétben, 30 percig, szobahőmérsékleten. A nemspecifikus antitestkötést Eraser és Sniper, a kecske, illetve nyúl primer antitestekhez specifikus blokkoló reagensekkel (Biocare Medical, Concord, Kalifornia, USA) blokkoltuk 5 percig. A metszeteket 1 órán át (h), szobahőmérsékleten inkubáltuk a CB1 és CB2 elleni primer antitestekkel, amelyeket 1 : 300, illetve 1 : 200 arányban hígítottunk foszfát pufferelt sóoldatban (PBS) a gyártó utasításai szerint. A metszeteket ezután szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk biotinilált kötő reagenssel (Biocare Medical), majd 10 percig peroxidáz-konjugált sztreptavidin jelölővel (Biocare Medical) inkubáltuk. Az így kapott immunperoxidáz-aktivitást DAB-szubsztrátkészlet (Vector Laboratories, Kalifornia, USA) segítségével 10 percig fejlesztettük. A metszeteket Harris’ hematoxilinnel ellenfestettük és Entellanban (Merck, Darmstadt, Németország) rögzítettük. A megfelelő negatív kontrollokat az elsődleges antitest elhagyásával és/vagy irreleváns antiszérummal való helyettesítésével végeztük el. Pozitív kontrollként ismert CB1 és CB2 expresszióval rendelkező emlő és mobil nyelv laphámsejtes karcinóma szöveti metszeteket használtunk. A follikuláris sejtek proliferatív kapacitását Ki-67 immunhisztokémiai expresszióval értékeltük, a korábban leírtak szerint .

2.3. Az immunhisztokémiai értékelés

Az immunhisztokémiai értékelést minden esetben legalább 1000 tumorsejt megszámlálásával végeztük két független, a klinikai adatokra vakon, teljes megfigyelői egyetértés mellett eljáró megfigyelő (Stamatios Theocharis és Paraskevi Alexandrou) által. A mintákat akkor tekintették “pozitívnak” a CB1 és CB2 tekintetében, ha a szelvényen belül a tumorsejtek több mint 5%-a pozitívan festődött. A tumorsejtek CB1 és CB2 immunreaktivitását a CB1 és CB2 pozitív tumorsejtek százalékos aránya szerint pontozták: 0: negatív festődés – a tumorsejtek 0-4%-a pozitív; 1: a tumorsejtek 5-24%-a pozitív; 2: a tumorsejtek 25-49%-a pozitív; 3: a tumorsejtek 50-100%-a pozitív és intenzitása 0: negatív festődés, 1: enyhe festődés; 2: közepes festődés; 3: intenzív festődés . Végül a CB1 és CB2 kifejeződését alacsony, ha az összpontszám 0 vagy 2 volt, és magas, ha az összpontszám ≥3 . A Ki-67 immunreaktivitást a pozitívan festett tüszősejtek százalékos aránya alapján a medián százalékos értéket meghaladóan két kategóriába soroltuk (átlagérték alatti és feletti), ahogyan arról korábban beszámoltunk .

2.4 . Statisztikai elemzés

Chi-négyzet tesztet alkalmaztunk a CB1 és CB2 expresszió különbségének értékelésére a malignus és benignus pajzsmirigy elváltozások, valamint a papilláris karcinóma esetei és a hyperplasztikus csomók között. Chi-négyzet teszteket alkalmaztunk a CB1 és CB2 expresszió és a klinikopatológiai jellemzők közötti összefüggések értékelésére a rosszindulatú pajzsmirigyelváltozásokban szenvedő betegek alcsoportjában. Statisztikailag szignifikánsnak tekintettük a 2-farkú értéket. A statisztikai elemzéseket az SPSS for Windows szoftvercsomag (13.0 verzió; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) segítségével végeztük.

3. Eredmények

3.1. Eredmények

3. A CB1 expresszió klinikai jelentősége humán rosszindulatú és jóindulatú pajzsmirigy elváltozásokban

A 87 pajzsmirigy elváltozásból 52-ben (60%) észleltek CB1 pozitivitást (IHC score > 0). A 87 vizsgált esetből 31 (36%) magas CB1-immunreaktivitást mutatott (IHC-pontszám ≥ 3). A CB1 szubcelluláris eloszlásának mintázata túlnyomórészt citoplazmatikus és esetenként membránszerű volt. A tumorral szomszédos normális környező területek CB1-negatívnak bizonyultak. A hiperplasztikus csomó és a papilláris karcinóma reprezentatív CB1-immunfestéseit az 1. a) és az 1. b) ábra mutatja. A CB1 immunreaktivitás szignifikánsan különbözött a benignus és malignus pajzsmirigyelváltozások között (1. táblázat, ). A magas CB1-expresszió szignifikánsan gyakrabban volt megfigyelhető a papilláris karcinómában, mint a hyperplasztikus csomókban (1. táblázat, ). A CB1-expresszió nem volt összefüggésben a betegek életkorával és nemével, valamint a follikuláris sejtek proliferatív képességével. A malignus pajzsmirigyelváltozások alcsoportjában a 44 esetből 23-ban (52%) észleltek magas CB1-expressziót. Nem volt összefüggés a CB1-receptor expressziója és a tumor mérete, a kapszuláris, ér- vagy nyirokinvázió jelenléte, a nyirokcsomó-metasztázis és a follikuláris sejtek proliferációs rátája között (2. táblázat). A CB1-receptor expressziója nem állt összefüggésben az ATA stádiumbeosztási rendszer szerint becsült kiújulási kockázattal (az adatok nem láthatóak).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. A CB2 expresszió klinikai jelentősége humán rosszindulatú és jóindulatú pajzsmirigyelváltozásokban

A 87 pajzsmirigyelváltozásból 61-ben (71%) észleltek CB2 pozitivitást (IHC score > 0). A 87 vizsgált esetből 32 (37%) magas CB2 immunreaktivitást mutatott (IHC score ≥ 3). A szubcelluláris eloszlási mintázat túlnyomórészt citoplazmatikus és esetenként membránszerű volt. A tumorral szomszédos normális környező területek CB2-negatívnak bizonyultak. A hiperplasztikus csomók és a papilláris karcinóma reprezentatív CB2 immunfestéseit az 1. (c) és az 1. (d) ábra mutatja. A magas CB2-expresszió szignifikánsan gyakrabban volt megfigyelhető a malignus pajzsmirigyelváltozásokban, mint a benignusokban, valamint a papilláris karcinómában, mint a hyperplasztikus csomókban (1. táblázat, illetve ,). A rosszindulatú pajzsmirigyelváltozások alcsoportjában a 44 esetből 24 esetben (55%) észleltek magas CB2-expressziót. A magas CB2-expresszió szignifikánsan összefüggött a nyirokcsomó-metasztázis jelenlétével (2. táblázat, ). A magas CB2-expresszió a kapszuláris, nyirokér-invazív és vaszkuláris invázió jelenlétével is összefüggött, bár nem szignifikáns szinten (2. táblázat, , , illetve ). A CB2-expresszió és a betegek életkora és neme, a tumor mérete és a follikuláris sejtek proliferációs rátája között nem észleltek összefüggést (2. táblázat). A magas CB2-receptor-expresszió gyakrabban volt megfigyelhető az ATA stádiumbeosztási rendszer szerint megnövekedett kiújulási kockázatot jelentő malignus pajzsmirigyelváltozásokban, bár nem szignifikáns szinten ().

4. Megbeszélés

A jelen vizsgálatban a CB1 és CB2 fehérje expressziója megnövekedett volt a malignus pajzsmirigyelváltozásokban a jóindulatúakhoz képest. Emellett először írunk le összefüggést a CB2 fehérjeexpresszió és a betegek kezelése és prognózisa szempontjából döntő klinikopatológiai paraméterek között. Nevezetesen, a fokozott CB2-expresszió szignifikánsan összefüggött a nyirokcsomó-metasztázisok jelenlétével és határesetben az érinvázió jelenlétével, míg indikatív, de nem szignifikáns összefüggéseket észleltünk a kapszuláris és nyirokinvázió jelenlétével és a becsült kiújulási rátával is. Hasonló eredményeket kaptunk a CB1 receptor overexpressziójára vonatkozóan, ami a malignus, szemben a benignus pajzsmirigy elváltozásokkal; mindazonáltal nem szignifikáns összefüggést vagy korrelációs tendenciát észleltünk a CB1 expresszió és a klinikopatológiai paraméterek között.

A jelen eredményekkel összhangban a CB receptorok felszabályozódtak bizonyos tumoros humán malignus daganatokban, beleértve a szájüregi laphámrákot, a hasnyálmirigy-, májsejtes és prosztatarákot, míg e szervek normál szöveteiben nem fejeződtek ki . Másrészt a CB1-receptor a colorectalis carcinomában a szomszédos normális szövetekkel ellentétben le volt szabályozva, ami rámutat az ECS különböző tumorokban betöltött különböző szerepeire, és jelzi az ECS és a sejtnövekedést és proliferációt szabályozó mechanizmusok közötti többszörös kölcsönhatásokat . Ezek a mechanizmusok magukban foglalhatják az átalakult sejtek halálának közvetlen indukcióját, a sejtciklus leállását, valamint a tumor angiogenezisének és metasztázisának gátlását . Az ECS tumorellenes hatásait is számos tanulmányban ábrázolták. Vastagbélrákban az endokannabinoidok és a szintetikus kannabinoidok képesek voltak apoptózist indukálni és gátolni a karcinogenezist a CB-receptorokat, a TRPV1-csatornákat és a PPARγ-utat egyaránt érintő mechanizmusok révén . Hasonló eredmények születtek a hasnyálmirigy-, tüdő- és emlőrák, az epekolangiókarcinóma és a hepatocelluláris karcinóma vizsgálataiban is . A kannabinoidoknak a hagyományos daganatellenes kemoterápiával való szinergista hatásairól is beszámoltak .

A közelmúltban pajzsmirigykarcinómában aCB receptor túlterjedéséről számoltak be, in vitro . Sőt, az anaplasztikus pajzsmirigy karcinóma sejtvonalak IL-12 stimulációja CB2 receptor overexpressziót indukált és CB2-agonisták által közvetített apoptózishoz és tumorregresszióhoz vezetett . Ezenkívül a CB2-felreguláció érzékenyebbé tette a tumorsejteket a standard kemoterápiás kezelésre . E jelenség egyik feltételezett magyarázata az volt, hogy a CB2-receptor aktiválása kiváltotta a mitokondriális intrinsic útvonal ceramid-függő aktiválódását, amely apoptózishoz vezet . Egy másik, pajzsmirigyrákos sejtvonalakon végzett vizsgálat azt mutatta, hogy a 2-metil-2′-F-anandamid (Met-F-AEA) gátolta a tumor növekedését, ami magas CB1-receptor-szintekhez társult . A CB1-receptor bőséges expresszióját a kezelésre érzékenyebb sejtvonalakban figyelték meg, amelyek ezt követően érzékenyebbek voltak a növekedés gátlására. Az ilyen eredményeket a p53 aktiválódásának, növekedésének és a ciklin A csökkenésének tulajdonították, ami apoptózishoz vezetett .

A tumorigenezisre és az ECS-re vonatkozó lehetséges terápiás vonatkozások mellett a CB-receptorok túlterjedésének kimutatása prognosztikai indikátorként is potenciális lehet. A hepatocelluláris karcinóma szövetmintáiban mindkét CB-receptor upregulációja szignifikánsan összefüggött a jobb prognózissal és a hosszabb betegségmentes túléléssel . Ezeket az eredményeket a szövettani tumorjellemzőkkel kombinálták, mivel magas CB-receptor-szintet figyeltek meg a jól differenciált és korlátozott portalis érintettségű esetekben . Másrészt a CB2 immunreaktivitás rövidebb betegségmentes túléléssel társult a fej-nyaki laphámsejtes karcinómában . Ami a CB1-receptort illeti, annak túlterjedése a betegek rossz kimeneteléhez társult vastagbél-, prosztata- és hasnyálmirigy-karcinómában . Különösen a CB1 fokozott expressziója a IV. stádiumú kolorektális karcinómás betegeknél függetlenül korrelált a rossz prognózissal . A CB1 fokozott expressziója agresszív prosztata adenokarcinómához is társult, amely magasabb Gleason-pontszámot, nagyobb tumorméretet és fokozott sejtproliferációs rátát, valamint metasztázisokat mutatott a diagnózis idején . Ezenkívül az alacsony CB1-expresszió vagy a magas FAAH/MAGL-szint összefüggött a hosszabb túlélési rátával és a magasabb fájdalomstátussal. Hasonló, de statisztikailag nem szignifikáns eredményeket tapasztaltak a CB2 receptor esetében . A fenti adatokat figyelembe véve a jelenleg rendelkezésre álló, a CB-receptorok szintjéről és a különböző daganatok prognózisával való összefüggéseiről szóló tanulmányok ellentmondásosnak tűnnek, és szorosan összefügghetnek az ECS tumorigenezisben való részvételének mértékével.

5. Következtetés

A CB1 és CB2 receptorok fokozott immunhisztokémiai expressziós szintje korrelált a pajzsmirigy rosszindulatúságával. Sőt, a CB2 fokozott expressziós szintje összefüggött a betegek terápiás kezelése szempontjából fontos klinikopatológiai jellemzőkkel. Ezek az eredmények alátámasztották annak bizonyítékát, hogy a CB-receptorok és különösen a CB2-receptor beavatkozhatnak a pajzsmirigy rosszindulatú átalakulásában részt vevő molekuláris útvonalakba, és potenciális terápiás célpontoknak tekinthetők a tumorprogresszió elnyomására. A CB-receptorok mint potenciális prognosztikai markerek klinikai hasznosságának megerősítése és megállapítása érdekében a pajzsmirigy daganatos megbetegedéseiben erősen ajánlott nagyobb kohorszvizsgálatok elvégzése.

Érdekellentét

Minden szerző igazolja, hogy nem fogadott el semmilyen finanszírozást vagy támogatást olyan szervezettől, amely bármilyen módon anyagi hasznot vagy veszteséget húzhat a jelen tanulmány eredményeiből. Valamennyi szerző igazolja, hogy nem állt olyan szervezet alkalmazásában, amely bármilyen módon anyagi hasznot vagy veszteséget húzhat a jelen tanulmány eredményeiből. A szerzők egyike sem áll egyéb összeférhetetlenségben.

A szerzők hozzájárulása

Eleftheria Lakiotaki és Constantinos Giaginis egyenlő mértékben járultak hozzá a tanulmányhoz.