Holliday-Kreuzung

Die beiden Wege der homologen Rekombination in Eukaryonten, die die Bildung und Auflösung von Holliday-Kreuzungen zeigen

Die Holliday-Kreuzung ist ein Schlüsselintermediär bei der homologen Rekombination, einem biologischen Prozess, der die genetische Vielfalt durch die Verschiebung von Genen zwischen zwei Chromosomen erhöht, sowie bei ortsspezifischen Rekombinationsereignissen unter Beteiligung von Integrasen. Sie sind außerdem an der Reparatur von Doppelstrangbrüchen beteiligt. Darüber hinaus können kreuzförmige Strukturen mit Holliday-Kreuzungen entstehen, um die helikale Spannung in symmetrischen Sequenzen in DNA-Supercoils zu verringern. Vierarmige Kreuzungen kommen zwar auch in funktionellen RNA-Molekülen vor, wie z. B. in der U1 spliceosomalen RNA und dem Haarnadel-Ribozym des Tabak-Ringspot-Virus, doch enthalten diese in der Regel ungepaarte Nukleotide zwischen den gepaarten doppelhelicalen Domänen und nehmen daher nicht strikt die Holliday-Struktur an.

Die Holliday-Kreuzungen bei der homologen Rekombination liegen zwischen identischen oder nahezu identischen Sequenzen, was zu einer symmetrischen Anordnung der Sequenzen um die zentrale Kreuzung führt. Dies ermöglicht einen Prozess der Verzweigungswanderung, bei dem sich die Stränge durch den Kreuzungspunkt bewegen. Die Spaltung bzw. Auflösung der Holliday-Kreuzung kann auf zwei Arten erfolgen. Die Spaltung des ursprünglichen Strangs führt zu zwei Molekülen, die zwar eine Genkonversion, aber kein chromosomales Crossover aufweisen, während die Spaltung des anderen Strangs dazu führt, dass die rekombinanten Moleküle ein Crossover aufweisen. Alle Produkte, unabhängig von der Spaltung, sind Heteroduplexe im Bereich der Holliday-Junction-Migration.

Viele Proteine sind in der Lage, die Struktur der Holliday-Junction zu erkennen oder zu verzerren. Eine dieser Klassen enthält Enzyme, die die Kreuzung auflösen, manchmal auf sequenzspezifische Weise. Solche Proteine verzerren die Struktur der Kreuzung auf verschiedene Weise, indem sie die Kreuzung oft in eine nicht gestapelte Konformation ziehen, die zentralen Basenpaare brechen und/oder die Winkel zwischen den vier Armen verändern. Andere Klassen sind Verzweigungsmigrationsproteine, die die Austauschrate um Größenordnungen erhöhen, und ortsspezifische Rekombinasen. In Prokaryonten fallen die Holliday-Junction-Resolvasen in zwei Familien, Integrasen und Nukleasen, die sich strukturell ähneln, obwohl ihre Sequenzen nicht konserviert sind.

In Eukaryonten gibt es zwei primäre Modelle dafür, wie die homologe Rekombination Doppelstrangbrüche in der DNA repariert: den Doppelstrangbruch-Reparaturweg (DSBR) (manchmal auch als Doppel-Holliday-Junction-Modell bezeichnet) und den Synthese-abhängigen Strangannealing-Weg (SDSA). Bei einem Doppelstrangbruch wird das 3′-Ende abgebaut und das längere 5′-Ende dringt in das benachbarte Schwesterchromatid ein und bildet eine Replikationsblase. Wenn sich diese Blase der gebrochenen DNA nähert, dringt der längere 5′-Antisense-Strang erneut in den Sense-Strang dieses DNA-Abschnitts ein und transkribiert eine zweite Kopie. Am Ende der Replikation werden die beiden Schwänze wieder miteinander verbunden und bilden zwei Holliday Junctions, die dann von Proteinen in verschiedenen Mustern gespalten werden. Eine Animation dieses Prozesses ist hier zu sehen.

Doppelstrang-DNA-Brüche in Bakterien werden durch den RecBCD-Weg der homologen Rekombination repariert. Brüche, die nur auf einem der beiden DNA-Stränge auftreten, so genannte Einzelstranglücken, werden vermutlich durch den RecF-Weg repariert. Sowohl der RecBCD- als auch der RecF-Weg umfassen eine Reihe von Reaktionen, die als Verzweigungsmigration bekannt sind, bei der einzelne DNA-Stränge zwischen zwei sich kreuzenden Molekülen der Duplex-DNA ausgetauscht werden, sowie die Auflösung, bei der diese beiden sich kreuzenden DNA-Moleküle auseinandergeschnitten und in ihren normalen doppelsträngigen Zustand zurückversetzt werden. Die homologe Rekombination kommt bei mehreren Gruppen von Viren vor. Bei DNA-Viren wie dem Herpesvirus erfolgt die Rekombination durch einen Break-and-Rejoin-Mechanismus wie bei Bakterien und Eukaryonten. In Bakterien wird die Wanderung der Verzweigung durch den RuvABC-Komplex oder das RecG-Protein erleichtert, molekulare Motoren, die die Energie der ATP-Hydrolyse nutzen, um die Verzweigung zu bewegen. Die Verzweigung muss dann in zwei getrennte Duplexe aufgelöst werden, wobei entweder die ursprüngliche Konfiguration oder eine gekreuzte Konfiguration wiederhergestellt wird. Die Auflösung kann bei der homologen Rekombination entweder horizontal oder vertikal erfolgen, wobei Patch-Produkte (wenn sie bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen gleich ausgerichtet sind) oder Spleißprodukte (wenn sie bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen unterschiedlich ausgerichtet sind) entstehen. RuvA und RuvB sind Verzweigungsmigrationsproteine, während RuvC ein kreuzungsauflösendes Enzym ist.

Es gibt Hinweise auf Rekombination bei einigen RNA-Viren, insbesondere bei ssRNA-Viren mit positivem Sinn wie Retroviren, Picornaviren und Coronaviren. Es ist umstritten, ob homologe Rekombination bei ssRNA-Viren mit negativem Sinn wie Influenza auftritt.

AuflösungBearbeiten

In der Knospenhefe Saccharomyces cerevisiae können Holliday-Kreuzungen durch vier verschiedene Wege aufgelöst werden, die im Wesentlichen für die gesamte Auflösung der Holliday-Kreuzung in vivo verantwortlich sind. Der Weg, auf dem die meisten Kreuzungen in der Hefe von S. cerevisiae und möglicherweise auch in Säugetieren stattfinden, umfasst die Proteine EXO1, MLH1-MLH3-Heterodimer (MutL gamma genannt) und SGS1 (Ortholog der Bloom-Syndrom-Helikase). Das MLH1-MLH3-Heterodimer bindet bevorzugt an Holliday-Kreuzungen. Es handelt sich um eine Endonuklease, die Einzelstrangbrüche in überspulter doppelsträngiger DNA verursacht. Das MLH1-MLH3-Heterodimer fördert die Bildung von Crossover-Rekombinanten. Während die anderen drei Wege, an denen die Proteine MUS81-MMS4, SLX1 bzw. YEN1 beteiligt sind, die Auflösung der Holliday-Kreuzung in vivo fördern können, hat das Fehlen aller drei Nukleasen nur einen geringen Einfluss auf die Bildung von Crossover-Produkten.

Doppelmutanten, bei denen sowohl MLH3 (Hauptweg) als auch MMS4 (Nebenweg) deletiert wurden, zeigten im Vergleich zum Wildtyp eine drastisch reduzierte Überkreuzung (6- bis 17-fach); die Lebensfähigkeit der Sporen war jedoch relativ hoch (62 %) und die chromosomale Disjunktion schien weitgehend funktionsfähig.

Obwohl MUS81 in der Meiose von Hefe, Pflanzen und Wirbeltieren eine Komponente eines untergeordneten Crossover-Wegs ist, scheint MUS81 im Protozoon Tetrahymena thermophila Teil eines wesentlichen, wenn nicht sogar des vorherrschenden Crossover-Wegs zu sein. Der MUS81-Weg scheint auch der vorherrschende Crossover-Weg in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe zu sein.

Die MSH4- und MSH5-Proteine bilden in Hefe und Mensch eine heterooligomere Struktur (Heterodimer). In der Hefe Saccharomyces cerevisiae wirken MSH4 und MSH5 spezifisch, um Kreuzungen zwischen homologen Chromosomen während der Meiose zu erleichtern. Der MSH4/MSH5-Komplex bindet und stabilisiert doppelte Holliday-Kreuzungen und fördert deren Auflösung in Crossover-Produkte. Eine hypomorphe (teilweise funktionsfähige) MSH4-Mutante von S. cerevisiae zeigte eine genomweite Verringerung der Crossover-Zahlen um 30 % und eine große Anzahl von Meiosen mit nicht ausgetauschten Chromosomen. Dennoch führte diese Mutante zu Sporenlebensfähigkeitsmustern, die darauf schließen lassen, dass die Segregation von nicht ausgetauschten Chromosomen effizient erfolgte. In S. cerevisiae hängt die korrekte Segregation also offenbar nicht vollständig von Kreuzungen zwischen homologen Paaren ab.