Herkunft der elektrophoretischen Kraft auf DNA in Festkörper-Nanoporen

Der spannungsgetriebene Transport von Makromolekülen durch biologische6,7 und künstliche8,9,10,11,12 Nanoporen bietet ein ideales System zur Untersuchung der Physik des Translokationsprozesses13. Die elektrophoretische Migration ist die Hauptantriebskraft für die DNA-Translokation durch Nanoporen und ist eine Folge der Kraft, die durch ein extern angelegtes elektrisches Feld auf die Ladungen der Polyelektrolytkette ausgeübt wird. Da die DNA in Lösung negativ geladen ist, wird sie von einer Schicht mehr oder weniger mobiler, positiv geladener Gegenionen abgeschirmt, die ebenfalls dem elektrischen Feld ausgesetzt sind. Es ist seit langem bekannt, dass die auf die Gegenionen ausgeübte Kraft eine hydrodynamische Widerstandskraft auf die DNA ausübt, die die elektrische Kraft lokal ausgleicht, was zu einer viel langsameren Migration führt, als man allein aufgrund des Stokes-Widerstands erwarten würde (siehe z. B. Ref. 1). Die elektrophoretische Translokation eines Polymers durch eine kleine Pore gehorcht ähnlichen Prinzipien, aber hier wird erwartet, dass die Geometrie der Pore (oder die lokale Struktur des Gels) das hydrodynamische Strömungsprofil um die DNA und damit die Widerstandskraft, die der Bewegung entgegenwirkt, stark beeinflusst1,5,14. Trotz immer ausgefeilterer Experimente3,12,15,16 wurde bisher noch kein eindeutiger Nachweis der hydrodynamischen Wechselwirkungen bei der DNA-Translokation erbracht. Hier gehen wir dieses Problem an, indem wir unseren kürzlich entwickelten Apparat verwenden, der Festkörper-Nanoporen mit optischen Pinzetten3 kombiniert, um die DNA-Translokation zu stoppen und anschließend die Abwürgekraft auf einen einzelnen DNA-Strang zu messen (siehe Abschnitt Methoden). Eine schematische Darstellung der Messapparatur ist in Abb. 1a zu sehen.

a, Schematische Darstellung der Messapparatur. Mit einer optischen Pinzette wird die DNA-Translokation gestoppt und die Kraft auf die DNA gemessen. Der Ionenleitwert der Nanopore wird ebenfalls gleichzeitig gemessen. b, Zylindrisches Modell der DNA in einer Nanopore. Die blauen Pfeile auf beiden Seiten der DNA stellen schematisch die Geschwindigkeit der sich bewegenden Flüssigkeit aufgrund der Elektroosmose dar.

Im Gegensatz zu einem Gelelektrophorese-Experiment ist das elektrische Feld in einem Nanoporen-Experiment auf die unmittelbare Umgebung der Pore beschränkt, und die elektrischen Kräfte wirken lokal auf einen kurzen Abschnitt der DNA. Die elektrische Feldstärke in der Pore erreicht aufgrund der sehr dünnen (∼60 nm) freistehenden Membranen typischerweise ∼106 V m-1. Die große Persistenzlänge der λ-DNA, etwa 50 nm, sorgt dafür, dass das DNA-Segment innerhalb der Pore praktisch vollständig ausgefahren ist. Die Situation ist in Abb. 1b schematisch dargestellt, wobei L und R die Länge und den Radius der Pore darstellen und ΔV das angelegte Potenzial ist. Die DNA hat eine reine Leitungsladungsdichte λbare=-0,96 nC m-1 (2 Elektronen pro Basenpaar) und wird hier als gleichmäßig geladener Zylinder mit dem Radius a=1,1 nm modelliert. Die reine elektrostatische Kraft auf das DNS-Rückgrat wird durch Fbare=λbareΔV dargestellt (Ref. 3). Ihr steht eine Widerstandskraft Fdrag gegenüber, die durch die elektrophoretische Bewegung der Gegenionen in die entgegengesetzte Richtung verursacht wird: Fdrag ist somit eine intrinsische Komponente des Translokationsprozesses, die letztlich auch auf elektrische Kräfte zurückzuführen ist5. Die resultierende Nettokraft ist die elektrophoretische Kraft, die die Translokation antreibt, gegeben durch Felec=Fbare-Fdrag. In unserem Fall wird Felec durch eine entgegengesetzte mechanische Kraft Fmech=-Felec von der optischen Pinzette ausgeglichen, die die DNA innerhalb der Pore festhält.

Der Ursprung von Fdrag liegt in der räumlichen Verteilung der Ionen und dem entsprechenden Flüssigkeitsstromprofil. Eine Mittelfeldbeschreibung der Ionenverteilungen ist durch den Poisson-Boltzmann-Formalismus gegeben, in dem das elektrostatische Potential durch und die entsprechenden Ionenverteilungen durch gegeben sind. Dabei ist λD die Debye-Länge, das reduzierte elektrostatische Potenzial, e die Elementarladung, Φ das Potenzial, kB die Boltzmann-Konstante, T die Temperatur, n die Ionenzahldichte und z die Wertigkeit der Ionenart. Abbildung 2a zeigt berechnete Potentiale für zwei Porengrößen, die durch numerische Auswertung der Poisson-Boltzmann-Gleichung in einer zylindrischen Geometrie erhalten wurden (siehe Abschnitt Methoden). Die entsprechenden Ionenverteilungen sind in Abb. 2b dargestellt. Die Debye-Schicht der DNA ist durch eine Verarmung an Koionen gekennzeichnet, während sich die Gegenionen aufgrund der hohen DNA-Ladung zu sehr hohen Dichten anhäufen. Da diese Verteilungen Lösungen der vollständigen (nichtlinearisierten) Poisson-Boltzmann-Gleichung sind, ist der Effekt der Manning-Kondensation17 enthalten.

a, Reduziertes elektrostatisches Potential für eine „große“ Pore (grün, R=10 nm) und eine „kleine“ Pore (blau, R=3 nm). Die graue Linie zeigt die Lage der Porenwand für die kleine Pore. Die Salzkonzentration beträgt cbulk=20 mM (λD=2,2 nm) und die Porenwände werden in dieser speziellen Berechnung der Einfachheit halber als ungeladen angenommen. b, Entsprechende Ionenverteilungen. In „großen“ Poren (R≫λD) wird die Verteilung der Ionen um die DNA durch die Porenwand nicht wesentlich beeinflusst, wie die Beobachtung zeigt, dass die grünen Kurven den Bulk-Wert erreichen. In „kleinen“ Poren (R≲λD) wird die Gegenionenwolke (durchgezogene Kurven) jedoch durch die Porenwand komprimiert, und die Pore kann an Gegenionen (gestrichelte Kurven) verarmt sein, so dass hauptsächlich positive Gegenionen übrig bleiben, um die negativen Ladungen der DNA auszugleichen. Diese Situation wird durch die blauen Kurven veranschaulicht. c, Geschwindigkeitsprofile der Flüssigkeit, berechnet durch Kombination der Ergebnisse von a und b mit der Stokes-Gleichung. d, Normalisiertes Oberflächenintegral der Schubspannung an jeder Position r, berechnet als , wobei τ die Schubspannung in der Flüssigkeit ist. An der DNA-Oberfläche . e, Berechnete reduzierte Oberflächenpotentiale für die DNA (rot) und die Nanoporenwand (grau) als Funktion des Porenradius. Der graue Bereich stellt qualitativ den Bereich der „kleinen Pore“ dar, in dem die Ionenverteilungen durch die Begrenzung der Nanopore beeinflusst werden.

In unserem DNA-Stalling-Experiment bestimmt die Verteilung der Gegenionen weitgehend das Geschwindigkeitsprofil des induzierten elektro-osmotischen Flusses. Das Strömungsgeschwindigkeitsprofil kann durch Lösen der Stokes-Gleichung berechnet werden, wobei η die dynamische Viskosität der Flüssigkeit, vz die Flüssigkeitsgeschwindigkeit, Ez das angelegte elektrische Feld und ρ(r) die Ionenladungsverteilung ist. Die berechneten Fließprofile sind in Abb. 2c dargestellt. Um das Strömungsprofil mit dem viskosen Widerstand in Beziehung zu setzen, wird die Schubspannung in der Flüssigkeit als τ(r)=-η(dvz/dr) berechnet. Abbildung 2d zeigt , was dem Verhältnis Fdrag/Fbare entspricht, wenn es an der DNA-Oberfläche (r=a) bewertet wird. Sie zeigt, dass Fdrag in der gleichen Größenordnung liegt wie die reine elektrostatische Kraft, die auf die DNA wirkt, der sie entgegenwirkt. Fdrag ist für die größere Pore größer, was einer geringeren Stalling-Kraft entspricht.

Für den Vergleich mit unseren Experimenten ist es praktisch, das obige Modell in einer Form auszudrücken, die die elektrophoretische Kraft direkt mit den Eigenschaften der Nanopore in Beziehung setzt. Wie bereits gezeigt5 , können die Poisson-Boltzmann- und die Stokes-Gleichung kombiniert werden, um einen Ausdruck für die elektrophoretische Kraft auf ein stationäres Molekül zu erhalten,

Φ(a) und Φ(R) sind die Oberflächenpotentiale der DNA bzw. der Nanopore, und ε ist die Dielektrizitätskonstante von Wasser. Die aus der Poisson-Boltzmann-Gleichung abgeleiteten Werte und sind in Abb. 2e als Funktion von R aufgetragen. In großen Poren sind die Oberflächenpotenziale unabhängig von R. Gleichung (1) sagt dann voraus, dass die gemessene Kraft Fmech eine einfache ln-1(R/a)-Abhängigkeit von der Porengröße hat. In kleineren Poren hingegen wird die Debye-Schicht durch die Porenwand zusammengedrückt (Abb. 2). Daraus ergibt sich eine Abhängigkeit der Oberflächenpotentiale von der Porengröße und eine entsprechend kompliziertere Abhängigkeit von Fmech von R.

Eine Möglichkeit, das obige Modell direkt zu testen, ist die Messung der DNA-Abwürgekraft Fmech als Funktion des Porenradius R. Da sich frühere Arbeiten jedoch auf kleinere Poren konzentrierten, zeigen wir zunächst, dass es möglich ist, die Anwesenheit eines einzelnen DNA-Moleküls in sehr großen (R≫a) Nanoporen nachzuweisen. Der Nachweis von DNA in der Pore basiert auf der Messung des Sprungs in der Ionenleitfähigkeit ΔG, wenn DNA in die Pore eintritt. Es wurde bereits gezeigt, dass ΔG durch die Konkurrenz zwischen zwei Beiträgen verursacht wird: Volumenausschluss, der die Anzahl der für die Leitfähigkeit verfügbaren Ionen verringert, und ein Überschuss an DNA-Gegenionen, der die Anzahl der für die Leitfähigkeit verfügbaren Ionen effektiv erhöht12. Welcher dieser beiden Effekte überwiegt, hängt von der Massenkonzentration des Elektrolyten ab, so dass ΔG in den vorliegenden Experimenten mit 20-50 mM Salz positiv ist (Leitfähigkeitssteigerung). Unter diesen optimierten Salzbedingungen dürfte das Signal-Rausch-Verhältnis des DNA-Einfangs selbst in sehr großen Poren hoch sein18. Ein typischer Stromsprung zusammen mit der entsprechenden Änderung der Position Z des Beads ist in Abb. 3a dargestellt. Wir beobachten einen deutlichen Stromsprung, obwohl die DNA die Leitfähigkeit der Nanopore um weniger als 1 % verändert. Ein typisches Histogramm der Capture-Ereignisse ist in Abb. 3b zu sehen. Diese Daten zeigen, dass wir in der Lage sind, einzelne Moleküle kontrolliert einzufügen und zu detektieren, sogar in Nanoporen mit R=45 nm, wo die DNA nur 1/2000stel der Querschnittsfläche der Nanopore bedeckt.

a, Typisches Beispiel des Porenstroms I (oberes Feld, roter Mittelwert) und der Bead-Position Z (unteres Feld) während des DNA-Einfangs in einer R=39 nm Pore in 33 mM KCl bei 80 mV. Die Strommessungen wurden bei 1 kHz tiefpassgefiltert. b, Histogramm von ΔG von 88 DNA-Aufnahmen in der Nanopore unter den gleichen Bedingungen wie in a. c, ΔG in Poren mit unterschiedlichen Radien. Die Einfangvorgänge fanden typischerweise bei Spannungen von 60-100 mV statt. Die horizontale gestrichelte Linie ist eine Orientierungshilfe für das Auge. Dreiecke: 20 mM KCl, Sterne: 33 mM KCl, Rauten: 50 mM KCl, grüner Stern: Daten aus b, Fehlerbalken: Standardabweichung, ermittelt aus ΔG-Histogrammen. Die offenen Symbole stellen Daten aus Experimenten zur freien Translokation ohne optische Pinzette dar.

Experimentell ermittelte ΔG-Werte als Funktion des Nanoporenradius sind in Abb. 3c für 10 Nanoporen mit Radien von R=3 bis 45 nm dargestellt. Der graue Bereich zeigt den Bereich der „kleinen Poren“ an, in dem nach den Berechnungen in Abb. 2b die Ionenverteilungen in der Nähe der DNA durch das Vorhandensein der Nanoporenwand beeinflusst werden. In offensichtlicher Übereinstimmung mit den Simulationen ist ΔG in großen Nanoporen annähernd konstant. Das größere ΔG in kleinen Nanoporen steht im Einklang mit der Kompression der diffusen Abschirmschicht, die die Ladungsneutralität in der Pore gewährleistet. Ein quantitativerer Vergleich des gemessenen ΔG mit der Theorie ist jedoch schwierig: Der Zugangswiderstand Racc wird in großen Poren zu einem immer wichtigeren Beitrag zum Gesamtwiderstand des Systems19, und es ist derzeit nicht bekannt, wie das Vorhandensein von DNA, die durch die Pore fließt, Racc beeinflusst.

Nachdem wir festgestellt haben, dass es möglich ist, DNA-Moleküle sowohl in großen als auch in kleinen Poren zu arretieren und zu detektieren, wenden wir uns nun dem Hauptergebnis dieses Schreibens zu, nämlich der experimentell bestimmten Größe der Abwürgekraft Fmech als Funktion des Nanoporenradius R. Abbildung 4a zeigt Fmech als Funktion der angelegten Spannung ΔV in Nanoporen mit R=4 nm (linke Tafel) und R=39 nm (rechte Tafel). Diese Beziehung ist in beiden Fällen annähernd linear. Allerdings ist Fmech/ΔV in der kleinen Pore um einen Faktor zwei größer als in der großen Pore. Abbildung 4b zeigt das Verhältnis Fmech/ΔV als Funktion der Porengröße: Fmech/ΔV nimmt mit zunehmender Größe allmählich ab, wie aufgrund von Gleichung (1) erwartet. Die gestrichelte Kurve ergibt sich aus der Kombination der Oberflächenpotentiale für die volle DNA-Ladung (Abb. 2e) mit Gleichung (1), ohne zusätzliche Anpassungen. Trotz der inhärenten Vereinfachungen eines eindimensionalen Modells gibt das theoretische Ergebnis den Trend in den Daten recht gut wieder, obwohl es die Abwürgekraft quantitativ um ∼50% überschätzt. Dieser Unterschied kann auf (eine Kombination von) mehreren Faktoren zurückgeführt werden, darunter eine Verringerung der Gegenionenmobilität an der DNA-Oberfläche12,20 oder ein zusätzlicher entgegengesetzter elektro-osmotischer Flüssigkeitsstrom, der sich aus festen Ladungen auf der Nanoporenoberfläche ergibt5. Im Sinne von Gleichung (1) können beide Effekte durch eine Verringerung der Größe der Oberflächenpotenzialdifferenz ΔΦ=Φ(a)-Φ(R) dargestellt werden, wodurch die Größe von Fmech verringert wird. Eine empirische Verringerung von ΔΦ um 33 % führt zu der durchgezogenen Kurve in Abb. 4b, die eine hervorragende Anpassung an die experimentellen Daten darstellt. Diese Verringerung von ΔΦ entspricht etwa 50 % der reinen Ladung der DNA, die durch Ionen abgeschirmt wird, die effektiv auf der Oberfläche immobilisiert sind (wie in der ergänzenden Abb. S1 gezeigt), oder dem Vorhandensein einer Oberflächenladung von 15 mC m-2 an der Porenwand (ergänzende Abb. S2). Obwohl unser Experiment nicht direkt zwischen diesen beiden Mechanismen unterscheiden kann, ist die abgeleitete Oberflächenladungsdichte typisch für SiO2-Oberflächen21. Dies deutet darauf hin, dass die Oberflächenladungsdichte in unseren Nanoporen nicht stark durch den Herstellungsprozess beeinflusst wird und dass die Porenladung für einen wesentlichen Teil der beobachteten Korrektur verantwortlich ist.

a, Messungen der Abwürgekraft als Funktion des angelegten Potentials in einer kleinen (linke Tafel) und einer großen Nanopore (rechte Tafel). In jedem Fall sind zwei Messungen gezeigt, die bei unterschiedlichen Abständen zwischen der Perle und der Nanopore durchgeführt wurden. b, Gemessene Kraft in Abhängigkeit vom Porenradius. Die blauen und grünen Symbole entsprechen den Daten in a. Die Daten im Bereich der kleinen Poren stammen aus Ref. 3. Die Kurven stellen das theoretische Ergebnis für die reine DNA-Ladung (gestrichelte Kurve) und für ein reduziertes ΔΦ (durchgezogene Linie, siehe Text) dar. Die Einfügung zeigt schematisch, wie die Kraft auf die DNA-Gegenionen zwischen der DNA und den Porenwänden durch den viskosen Widerstand in einer kleinen und einer großen Pore aufgeteilt wird; der gelbe Pfeil stellt die reine elektrostatische Kraft dar, die auf die DNA wirkt. Dreiecke: 20 mM KCl, Sterne: 33 mM KCl, Rauten: 50 mM KCl. Die Fehlerbalken ergeben sich aus den Unsicherheiten bei der Kalibrierung der optischen Falle, die auf 10-30 % der kalibrierten Fallensteifigkeit geschätzt werden.

Außere Faktoren, die in unserem einfachen Modell nicht berücksichtigt wurden, könnten den absoluten Wert der Abwürgekraft ebenfalls beeinflussen. So könnte sie beispielsweise durch elektrostatische und/oder hydrodynamische Kräfte auf das Bead oder auf den Teil der DNA beeinflusst werden, der sich im elektrischen Feld direkt außerhalb der Nanopore befindet. Unsere Experimente zeigen jedoch keine Hinweise auf solche Effekte, da wir keine Veränderung der Abwürgekraft feststellen konnten, als das Bead in zunehmendem Abstand von der Nanopore positioniert wurde3. Darüber hinaus sind die experimentellen Kraft-Spannungs-Kurven in unserem Spannungsbereich (Abb. 4a) linear, was darauf hindeutet, dass die entropischen Kräfte im Vergleich zu den elektrostatischen Kräften gering sind, was mit unabhängigen Messungen der entropischen Kräfte bei der DNA-Streckung übereinstimmt22.

Die Abhängigkeit der gemessenen Kraft vom Porenradius in Abb. 4b zeigt direkt, dass die elektrophoretische Kraft bei der DNA-Translokation zum Teil durch die hydrodynamische Kopplung zwischen den DNA-Gegenionen und der Nanoporenwand bestimmt wird. Die Geometrie der Nanopore bestimmt die Größe der Widerstandskraft, die von diesen Gegenionen auf die DNA ausgeübt wird. Diese Kopplung hat wichtige Konsequenzen für die Interpretation experimentell ermittelter Kräfte, da diese Kräfte offensichtlich nicht allein durch die intrinsischen Eigenschaften der DNA bestimmt werden1,23.

Variationen der Kraft sind auch mit zunehmender Salzkonzentration zu erwarten, da sich dadurch die Debye-Länge und damit sowohl das DNA-Oberflächenpotenzial als auch vermutlich die Stalling-Kraft Fmech ändert. Diese Erwartung wird jedoch durch die Tatsache erschwert, dass sich auch die Oberflächenladungsdichte der Poren mit der Salzkonzentration erheblich ändert12 und dass die hier verwendete Theorie des mittleren Feldes bei hoher Ionenstärke unzuverlässig wird. In früheren Experimenten erwies sich Fmech als unabhängig von der Salzkonzentration bis zu 1 M (Ref. 3), und eine Interpretation dieser Daten auf der Grundlage eines Modells, in dem Φ(R) von der Salzkonzentration abhängt, wurde von Ghosal5 vorgeschlagen.

Bei der freien DNA-Translokation ist die Rückstellkraft Fmech nicht vorhanden und wird effektiv durch einen zusätzlichen Stokes-Widerstand FStokes ersetzt, der proportional zur Geschwindigkeit des Moleküls ist. Das Molekül verlagert sich mit konstanter Geschwindigkeit, wobei die elektrophoretische Kraft durch FStokes ausgeglichen wird. Das Verhältnis zwischen der mit der optischen Pinzette gemessenen Stokes-Kraft Fmech und der Translokationsgeschwindigkeit vtrans, die aus Experimenten zur freien DNA-Translokation ermittelt wurde, ist gegeben durch4,5,14

Dieses Ergebnis entspricht dem Stokes-Widerstand, den ein ungeladener Zylinder erfahren würde, der sich mit konstanter Geschwindigkeit vtrans durch eine zylindrische Pore bewegt. Somit sind Fmech und vtrans proportionale Größen, die durch einen geometrieabhängigen Faktor miteinander verbunden sind. Diese Erwartung wird qualitativ durch experimentelle Daten3,12 bestätigt, die zeigen, dass Fmech und vtrans tatsächlich ungefähr proportional sind. Die Berechnung von vtrans als λ-DNA-Konturlänge geteilt durch die experimentell ermittelte Translokationszeit ergibt vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, was zu Fmech/vtrans=1.750 pN s m-1 führt (Daten für Poren mit einem Radius von 5 nm). Gleichung (2) ergibt jedoch einen Wert von 249 pN s m-1 für diesen Faktor, wenn man η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm und a=1,1 nm verwendet. Dies ist siebenmal niedriger als der experimentell ermittelte Wert. Die Translokation der DNA durch diese Poren erfolgt also mit einer viel geringeren Geschwindigkeit als aufgrund der mit der optischen Pinzette gemessenen elektrophoretischen Kräfte und der Beschreibung des mittleren Feldes erwartet. Da in all diesen Experimenten ähnliche Nanoporen verwendet wurden, weist diese Schlussfolgerung auf einen grundlegenderen Unterschied zwischen der statischen Situation eines festgefahrenen Moleküls und der dynamischen Situation eines translozierenden Moleküls hin. Bei der freien DNA-Translokation führt die Konformation der DNA außerhalb der Pore zu einem zusätzlichen Widerstand für das sich bewegende Molekül24, was die Diskrepanz erklären könnte.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die elektrophoretische Kraft auf ein DNA-Molekül in einer Nanopore von der Geometrie der Pore abhängt. Dies ist aus der einfachen Elektrostatik nicht zu erwarten, lässt sich aber leicht verstehen, wenn man den hydrodynamischen Widerstand berücksichtigt, der durch die Gegenionen entsteht, die die DNA in Lösung abschirmen. Numerische Berechnungen auf der Grundlage von Gleichungen für mittlere Felder liefern eine gute Beschreibung der Abhängigkeit der gemessenen Kräfte von der Porengröße.