Guanidin

Membranproteine

Guanidin und SDS-Lösungen sind denaturierende Lösungsmittel, aber wir wollten natürlich auch den nativen Zustand von Membranproteinen charakterisieren. Die Schwierigkeit dabei war, dass es noch keinen Konsens darüber gab, wie man den nativen Zustand definieren oder konzipieren sollte – was für Neulinge wie uns Unsicherheit bedeutete, weil wir nicht über die Art von Erfahrung verfügten, die es uns ermöglichen würde, eine kluge Vermutung darüber anzustellen, welche der konkurrierenden Ideen sich wahrscheinlich als richtig erweisen würde.

Selbst die Phospholipid-Doppelschicht, das einzige unverzichtbare Konzept für das minimalste Verständnis von Zellmembranen, war immer noch umstritten, obwohl sie fast 50 Jahre zuvor erstmals an roten Blutkörperchen nachgewiesen worden war und eigentlich die einzige thermodynamisch denkbare Anordnung darstellte, eine direkte Folge der klassischen Messungen von Irving Langmuir aus dem Jahr 1917 mit Monoschichten aus amphiphilen Substanzen. Ich habe die lächerlich langsame Akzeptanz des Konzepts der Doppelschichten in der Zwischenzeit in meinem Buch Ben Franklin Stilled the Waves beschrieben. Hier geht es darum, dass die Skepsis noch anhielt, als wir uns mit der Membranforschung befassten.

Und unter denen, die von der Lipiddoppelschicht überzeugt waren, war die Art und Weise des Einbaus von Proteinen in Membranen immer noch umstritten. Einige, wie unser Kollege David Robertson aus Duke, zögerten zu glauben, dass Proteine tatsächlich eine Doppelschicht durchdringen oder durchqueren könnten. In Abbildung 3 sind zwei recht unterschiedliche konzeptionelle Vorstellungen dargestellt, die auf einer Konferenz der New York Academy of Sciences im Jahr 1972 entstanden. Das eine ist die „Einheitsmembran“ von Robertson, bei der das Protein ganz außen liegt. Das andere zeigt Vanderkoois Ansicht von Cytochrom-Oxidase-Komplexen in mitochondrialen Membranen: Das Protein ist realistischer positioniert, aber es gibt noch keine Vorstellung von unterschiedlichen hydrophilen und hydrophoben Domänen und wie diese die Protein-Lipid-Wechselwirkung bestimmen könnten. Später, im selben Jahr 1972, wurde das jetzt übliche idealisierte Bild von Phospholipid-Doppelschichten, durch die funktionierende Proteine laufen, schließlich durch das „Flüssigkeitsmosaik“-Modell von Singer und Nicolson popularisiert.

Abbildung 3. Zwei unterschiedliche konzeptionelle Vorstellungen von Membranproteinen, die beide 1972 auf der gleichen Tagung in New York vorgeschlagen wurden: (a) Robertson dachte, dass Proteine asymmetrisch angeordnet sind, außerhalb der beiden Doppelschichtoberflächen; (b) Vanderkoos Ansicht von Cytochromoxidase-Komplexen im Querschnitt.

Im Labor waren dies aufregende Zeiten, die aufregendsten, an die ich mich erinnern kann. Wir lernten, gutartige Detergenzien zu verwenden, die im Gegensatz zu SDS Membranproteine ohne grobe Denaturierung in einer Umgebung auflösen konnten, die den nativen Zustand simulierte, aber eine Umgebung, in der sie auch für die molekulare Charakterisierung leicht zugänglich waren – ein Fortschritt, bei dem uns zwei sympathische junge Männer aus Finnland, Kai Simons und Ari Helenius, zum Teil zuvorgekommen waren.

In der Praxis beschränkten wir uns immer noch weitgehend auf die Messung des Molekulargewichts und die Frage, wie viele Polypeptidketten pro Molekül vorhanden waren, aber die Proteine, auf die sich diese Fragen bezogen, waren durch Detergenzbehandlung von anderen Membranbestandteilen getrennt worden. Das Wichtigste war, dass viele der Proteine eine bekannte zelluläre Funktion hatten und unsere Messungen für diese Funktionen relevant waren. Ich habe bereits die roten Blutkörperchen erwähnt, aber es gelang uns tatsächlich, eine Reihe biologisch relevanter Themen abzudecken, in vielen Fällen angespornt durch den missionarischen Eifer der Studenten. So kam zum Beispiel ein Doktorand der Physiologie, Stuart Grefrath, der sich für Neurophysiologie interessierte, in unser Labor, um die Polypeptidketten einer erregbaren Membran aufzuzählen – in diesem Fall aus dem Geruchsnerv des Hornhechtes – und dies führte dazu, dass wir uns später mit mehreren anderen aktiven Transportsystemen beschäftigten. (Stuart selbst starb leider an den Folgen einer angeborenen Herz-Kreislauf-Erkrankung, bevor er sein frühes Versprechen mit einer unabhängigen Karriere erfüllen konnte). Das zerebrale Myelin war eine weitere Membran des Nervensystems, die wir untersuchten.

Ebenfalls erwähnenswert sind zwei Besucher des Labors, die sich für eine Zusammenarbeit entschieden: Neal Robinson, ein Postdoc-Stipendiat, und Leon Visser, der vom CSIR in Pretoria, Südafrika, beurlaubt war.) Sie leisteten eine sehr gute Arbeit bei der quantitativen Definition der Domänenstruktur von Cytochrom b5, eine Art Prototyp zur Veranschaulichung der Art und Weise, wie Membranproteine an Membranen gebunden sind und dennoch ihre Funktion im angrenzenden Zytoplasma erfüllen.

In anderen Projekten reagierten wir auf Anfragen von entfernten Kollegen. Ich habe bereits die Arbeit mit Arthur Karlin über den Acetylcholinrezeptor eines elektrischen Fisches erwähnt. Ein weiteres Beispiel war das Bacteriorhodopsin, für das wir auf Veranlassung von Walter Stoeckenius von der Universität von Kalifornien Messungen in Detergenzlösung durchführten. Hier stellte sich eine wichtige Frage, die mit dem Mechanismus der Protonenpumpaktivität dieses Proteins zusammenhängt: Ist das native Protein funktionell ein Monomer oder (wie einige Daten nahe zu legen schienen) ein Trimer? Unser solubilisiertes Protein war zweifellos ein Monomer, und die spektralen Beweise deuteten darauf hin, dass es denselben Zyklus molekularer Veränderungen durchlief wie die native Membran.

In den meisten Fällen waren wir selbst nicht direkt an dem Versuch beteiligt, die Funktionsweise von Rezeptoren, Pumpen oder Kanälen zu enträtseln, aber wir wurden uns unweigerlich der Probleme bewusst. Es war eine wirklich bereichernde Erfahrung, ganz anders als in den Tagen, als Serumalbumin und β-Lactoglobulin (von kommerziellen Anbietern) die Hauptziele unserer Forschung waren.

Im Falle der Ionenpumpen haben wir uns tatsächlich mit der Physiologie beschäftigt, meist auf der Ebene von Hypothesen oder Theorien; wir lernten, wie man kinetische Schemata mit einem Computer modelliert; wir nahmen an entsprechenden Konferenzen teil usw. Unser letzter Sabbatical-Urlaub – am Max-Planck-Institut in Heidelberg – war in dieser Hinsicht wichtig. Der Vorsitzende der physiologischen Abteilung in Duke, Ted Johnson, schloss sich uns bei dieser Gelegenheit an, so dass wir zu dritt aktiv zusammenarbeiteten. Ted war schon lange ein Computerenthusiast und hatte jedes einzelne Mitglied der Physiologie-Fakultät an die zentrale Computereinrichtung des North Carolina Research Triangle angeschlossen, bevor es in Mode kam, Abteilungsgelder auf diese Weise auszugeben. Damals mussten wir unsere eigenen Programme für den Computer schreiben, was mir schwer fiel, aber ich glaube, wir haben einige nützliche Ergebnisse erzielt, vor allem bei kinetischen Modellen für den Pumpzyklus der ATP-getriebenen Na,K-Pumpe. Wir arbeiteten zu unorthodoxen Zeiten, auch an Wochenenden und Feiertagen, was unsere Heidelberger Gastgeber manchmal verärgerte, die es gewohnt waren, die Zentralheizung abzustellen, wenn das Labor nicht besetzt sein sollte. Etwa alle zehn Tage fuhren wir über die Grenze nach Straßburg, um dort ein Gourmet-Mittagessen einzunehmen – begleitet von elsässischen Weinen, deren Geschmack wir seither genießen.