Genomische Differenzierung und interkontinentale Populationsstruktur der Stechmückenüberträger Culex pipiens pipiens und Culex pipiens molestus

Unabhängige monophyletische Herkunft von Culex pipiens pipiens und Culex pipiens molestus

Zwei alternative Hypothesen wurden vorgeschlagen, um die Unterschiede in den ökologischen und physiologischen Strategien von Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus zu erklären19. Eine Hypothese erklärt eine solche Differenzierung als rasche Veränderung der physiologischen und Verhaltensmerkmale als Anpassung an eine unterirdische Umgebung, die mit menschlichen Aktivitäten verbunden ist22. In diesem Szenario müssen die lokalen Populationen von Cx. p. molestus eng mit den lokalen Populationen von Cx. p. pipiens verwandt sein30. In diesem Szenario wird Cx. p. molestus als eine öko-physiologische Variante von Cx. p. pipiens betrachtet. Eine alternative Hypothese besagt, dass der Unterschied zwischen Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus auf eine unterschiedliche Evolutionsgeschichte zurückzuführen ist. Die ökologischen und physiologischen Strategien von Cx. p. molestus könnten zunächst in einem warmen Klima entstanden sein19. Später wurde eine solche Strategie durch menschliche Aktivitäten relevant, die eine unterirdische Umgebung schufen und so Cx. p. molestus über die ganze Welt verbreiteten. Bei diesem Szenario werden Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens als getrennte evolutionäre Einheiten betrachtet.

In unserer Studie haben wir diese Hypothesen anhand einer Ganzgenomanalyse von 40 Cx. p. molestus- und Cx. p. pipiens-Proben aus vier Orten in Eurasien und Nordamerika getestet. Unsere Ergebnisse wiesen die Hypothese einer Wiederentstehung von Cx. p. molestus aus den lokalen Populationen von Cx. p. pipiens zurück und stützten die Idee eines unabhängigen monophyletischen Ursprungs von Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus aus verschiedenen Kontinenten. NJ- und ML-Analysen bilden separate Cluster für Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus aus der Republik Belarus, der Kirgisischen Republik und Chicago, IL, USA (Abb. 2, ergänzende Abbildungen 1-3). Das Vorhandensein eines zusätzlichen Hybridclusters, der aus autogenen und anautogenen, im Feld gesammelten Exemplaren aus Washington, D.C., USA, besteht, spiegelt wahrscheinlich die Existenz einer Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus Hybridzone in diesem Gebiet wider16. Auf der Grundlage der genetischen Abstände ist dieser Cluster jedoch viel enger mit der eurasischen Cx. p. pipiens verwandt als mit der Cx. p. molestus aus Eurasien und den USA (Chicago, IL). Darüber hinaus ergaben die PCA- (Abb. 3) und ADMIXTURE-Analysen (Abb. 4) zwei unterschiedliche genetische Cluster, die Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus entsprechen. In beiden Fällen wurden alle Exemplare aus Washington, D.C. zusammen mit Cx. p. pipiens aus anderen Orten geclustert. Die genomweiten paarweisen Fst-Werte waren für alle Vergleiche hoch signifikant (Abb. 5). Wir konnten keine spezifische Region mit hoher Divergenz im Genom identifizieren (Abb. 6). Insgesamt waren die Fst-Werte zwischen Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens viel höher als zwischen autogenen und anautogenen Proben von Cx. p. pipiens aus Washington, D.C. Die am stärksten divergierende Gruppe, basierend auf allen durchgeführten Analysen, war der Stamm von Cx. p. molestus aus Chicago, IL, was durch die sehr geringe genetische Vielfalt dieses Stammes erklärt werden kann, die durch seine langjährige Besiedlung und einen möglichen Flaschenhals verursacht wurde, der die genetische Drift beschleunigte (Abb. 7).

Ähnliche Beobachtungen über den unabhängigen monophyletischen Ursprung von Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens wurden mit Hilfe der Mikrosatelliten-Analyse in ~600 Proben von Cx. pipiens-Mücken aus verschiedenen weltweiten Standorten gemacht19. Das Verfahren des unbewurzelten Distanzbaums gruppierte oberirdische Populationen von Cx. p. pipiens und unterirdische Populationen von Cx. p. molestus aus Nord- und Südeuropa getrennt. Ähnlich wie in unserer Studie bildeten die oberirdischen Populationen von Cx. p. pipiens aus den USA einen zusätzlichen Cluster, was auf eine intensivere Hybridisierung zwischen den Mitgliedern des Cx. pipiens-Komplexes in Nordamerika schließen lässt. Die Vermischungsanalyse zeigte das Vorhandensein von drei großen Clustern, die Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens und Cx. quinquefasciatus entsprachen. Der letztgenannte Cluster wurde in dieser Studie nur in den Proben aus den USA gefunden. In einer anderen Arbeit, die auf AFLP-Analysen (Amplified Fragment Length Polymorphism) basierte, wurden Proben aus Süd- und Nordeuropa sowie Stämme aus Chicago, IL, USA, verglichen24. Die in dieser Studie verwendeten nordamerikanischen und europäischen Populationen zeigten beim AFLP-Genomscan ein ähnliches ADMIXTURE-Muster. Die Analyse der COI-Gene deutete ebenfalls auf einen monophyletischen Ursprung von Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus in Europa, Asien und Afrika hin26.

Der unabhängige monophyletische Ursprung und das hohe Maß an genetischer Divergenz zwischen Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens legen also nahe, dass diese beiden Mitglieder des Cx. pipiens-Komplex unterschiedliche phylogenetische Einheiten mit unabhängiger Evolutionsgeschichte vor der vom Menschen vermittelten Translokation darstellen.

Konzepte der Speziation und Evolution des Culex pipiens-Komplexes

Die theoretischen Modelle der Speziation bei Tieren können in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: allopatrische oder geographische Speziation und sympatrische oder ökologische Speziation. Das erste Konzept der Artbildung, das von E. Mayr3 intensiv gefördert wurde, geht davon aus, dass die entstehenden Taxa zunächst geografisch isoliert werden. Diese Situation reduziert den Genfluss zwischen den Populationen und kann zu einer Anhäufung von Mutationen führen, die eine genetische Inkompatibilität zwischen den Hybriden verursachen. Ein alternatives Konzept der Artbildung betont ökologische Barrieren zwischen den entstehenden Taxa als Haupttriebkräfte der Evolution31. In diesem Szenario wird die Entwicklung einer reproduktiven Isolation zwischen den Populationen als Ergebnis der Anpassung an unterschiedliche Umwelten ohne geografische Isolation betrachtet, die in der Regel angesichts des Genflusses eintritt. In dieser Situation sind die Hybriden zwischen den sich entwickelnden Taxa weniger gut an die Umwelt angepasst, was die natürliche Selektion von Merkmalen fördert, die die Paarung zwischen ihnen einschränken. Wir sind der Meinung, dass die Gesamtdiversifizierung der Unterarten von Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus ein bemerkenswertes Beispiel für die Artbildung durch isolierende ökologische Mechanismen darstellt. In unserer Studie ergab die Fst-Analyse ein signifikantes Maß an genomischer Divergenz zwischen Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus (Abb. 5 und 6) über das gesamte Genom hinweg, ohne klare Inseln der Speziation. Überraschenderweise war der Grad der Differenzierung um die Zentromere herum geringer, was wahrscheinlich auf die geringe Anzahl zuverlässiger SNVs in diesen hoch repetitiven Regionen zurückzuführen ist. Die Differenzierung war extrem hoch zwischen den Stämmen von Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus aus Chicago, IL, USA, aber geringer zwischen den Unterarten in den eurasischen Mückensammlungen. Insgesamt deuten diese Beobachtungen auf eine erhebliche Einschränkung des Genflusses zwischen den Unterarten hin.

Es wurden mehrere Mechanismen der reproduktiven Isolation zwischen Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus beschrieben17. Zwei davon wirken präzygotisch, also vor der Befruchtung, und reduzieren die Paarungsmöglichkeiten der Mücken. Der erste Mechanismus hängt mit der Habitatspezialisierung der Larven zusammen: Cx. p. molestus bewohnt Keller oder andere unterirdische Umgebungen, während Cx. p. pipiens offene, oberirdische Gewässer als Brutplätze bevorzugt. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass die beiden Unterarten aufeinandertreffen und sich im Erwachsenenstadium paaren. Der zweite Isolierungsmechanismus beruht auf den Unterschieden im Paarungsverhalten von Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens. Die Männchen von Cx. p. molestus bilden in der Regel homogene Schwärme in Bodennähe und benötigen nur wenig Platz für die Paarung17. Im Gegensatz dazu schwärmen die Männchen von Cx. p. pipiens in der Nähe des Laubes, etwa 2-3 m über dem Boden. Experimentelle Studien zum Paarungsverhalten in kleinen Käfigen ergaben, dass bei Kreuzungen von Weibchen und Männchen von Cx. p. molestus der Kopulationserfolg bei 90 % lag, bei Cx. p. pipiens jedoch nur bei 3,3 %32. Bei Kreuzungen zwischen Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens war der Kopulationserfolg ebenfalls gering und schwankte je nach Geschlecht der Unterarten zwischen 6,6 % und 10 %. Diese Studie zeigte, dass die Weibchen beider Unterarten die Kopulation mit Männchen einer anderen Unterart aktiv vermeiden. Darüber hinaus waren die Weibchen von Cx. p. pipiens nicht in der Lage, Spermien von Cx. p. molestus zu empfangen, und produzierten daher keine Eier.

Zwei weitere Mechanismen zur Isolierung der Fortpflanzung, die für Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus beschrieben wurden, sind postzygotisch, sie wirken nach der Paarung und führen zu einer geringeren Fitness der Hybriden. Einer der Mechanismen steht im Zusammenhang mit der Vererbung der Diapause in Hybriden von Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens als rezessives Merkmal8. F1-Hybriden und ein erheblicher Teil der F2-Hybriden sind nicht in der Lage, eine Diapause zu entwickeln und können unter Winterbedingungen nicht überleben. Dieser Mechanismus könnte vielleicht die höheren Introgressionsraten bei Cx. p. pipiens in südlichen Gebieten erklären19,23,24. Schließlich sind die Mitglieder des Cx. pipiens-Komplexes der zytoplasmatischen Inkompatibilität von Hybriden ausgesetzt, die mit verschiedenen Stämmen des Rickettsienparasiten Wolbachia pipientis infiziert sind. Trotz der zytoplasmatischen Introgression dieses Parasiten durch Hybridisierung zwischen den Mitgliedern des Cx. pipiens-Komplexes33 könnte die zytoplasmatische Inkompatibilität die Überlebensraten der Hybriden erheblich einschränken. So verringerte beispielsweise eine Infektion mit W. pipientis die Hybridisierung zwischen Cx. pipiens und Cx. quinquefasciatus in Südafrika erheblich34. Eine andere Studie zeigte, dass Cx. p. molestus in eurasischen Populationen nur von einem Stamm von W. pipientis infiziert wurde, Cx. p. pipiens jedoch von zwei verschiedenen Stämmen35. Außerdem waren die Exemplare von Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens, die wir in unserer Studie verwendeten, im Süden der Kirgisischen Republik mit denselben Stämmen von W. pipientis infiziert, im Norden der Republik Belarus jedoch mit unterschiedlichen Stämmen. Dies könnte die Unterschiede in der Introgression von Cx. p. molestus zu Cx. p. pipiens erklären, die in der Republik Belarus stärker ausgeprägt war als in der Kirgisischen Republik. Ein interessantes Beispiel für infektiöse Speziation wurde im südamerikanischen Drosophila paulistorum-Komplex beschrieben. In diesem Komplex wurden sechs Halbspezies mit überlappender geografischer Verbreitung infolge der durch die Wolbachiae-Infektion ausgelösten Isolation vor und nach der Paarung reproduktiv isoliert36.

Neuere genomische Studien, die an verschiedenen Organismen wie Drosophila simulans37, Rhagoletis-Fruchtfliegen38,39 und Heliconius-Schmetterlingen40,41 durchgeführt wurden, liefern weitere Beweise dafür, dass ökologische Speziation in der Natur stattfindet. Die genomischen Muster der Speziation können sehr unterschiedlich sein2 und reichen von kleinen genomischen Inseln der Speziation40 bis hin zu erheblichen Divergenzen im gesamten Genom. Eine weit verbreitete genomische Divergenz wurde zwischen den im Entstehen begriffenen Arten Anopheles gambiae und An. coluzzii innerhalb des An. gambiae-Komplexes festgestellt42. Ursprünglich wurden diese Arten aufgrund von Unterschieden in der Struktur ihrer ribosomalen DNA als S- und M-Formen identifiziert43, doch später wurde ihr taxonomischer Status auf Artniveau angehoben44. Es wird angenommen, dass An. gambiae und An. coluzzii aufgrund ihrer unterschiedlichen ökologischen Präferenzen Fortpflanzungsbarrieren in Sympatrie entwickeln45. Das Larvenstadium von An. gambiae ist an kleine Regenbecken gebunden. Im Gegensatz dazu nutzt An. coluzzi beständige Wasserreservoirs, die mit dem Reisanbau verbunden sind. Obwohl die Paarungsbarrieren zwischen den Arten unvollständig sind46, haben sie Unterschiede in ihrem Schwarmverhalten47,48 und unterschiedliche Gesangsarten entwickelt49.

Das hohe Maß an genomweiter Divergenz, die auffallenden Unterschiede in der Anpassung an verschiedene ökologische Umgebungen und die Hinweise auf präzygotische und postzygotische Paarungsbarrieren legen nahe, dass Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus unterschiedliche ökologische Einheiten darstellen, die eine beginnende ökologische Speziation durchlaufen.

Hybridisierung im Culex pipiens-Komplex

Die interessanteste Beobachtung bei den Mitgliedern des Cx. pipiens-Komplexes ist, dass sie trotz der Unterschiede in Ökologie, Physiologie, Verhalten und geografischer Verbreitung in der Natur hybridisieren und lebensfähige Nachkommen produzieren können, was darauf hindeutet, dass die reproduktive Isolation zwischen ihnen nicht vollständig ist. Unsere Studie zeigte auch signifikante Hybridisierungsereignisse zwischen den Unterarten Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens. Der Vergleich des gesamten Genoms zeigte, dass die meisten Proben von Cx. p. pipiens Individuen mit einem gewissen Grad an Introgression von Cx. p. molestus darstellen (Abb. 4). Wir beobachteten eine große Diskrepanz zwischen der nuklearen und der mitochondrialen Phylogenie (Abb. 2, 8), was darauf hindeutet, dass die Übertragung des mitochondrialen Genoms historisch gesehen zwischen den Unterarten stattfinden kann. Gleichzeitig konnten wir keine gemeinsamen Haplogruppen zwischen den lokalen Populationen der Unterarten feststellen. Auf den Kontinenten waren alle mitochondrialen Phylogenien stark monophyletisch, was auf eine durch Männchen vermittelte Ausbreitung und Hybridisierung hinweist. Die Vermischung mit Cx. p. molestus war in den südlichen Populationen von Cx. p. pipiens in der Kirgisischen Republik und in Washington, D.C., USA, höher, in den nördlichen Populationen in der Republik Belarus und in Chicago, IL, USA, jedoch geringer. Dies könnte damit zusammenhängen, dass die Hybriden nicht in der Lage sind, in kalten Klimazonen eine Diapause zu entwickeln. Zum Vergleich: Mikrosatellitenanalysen ergaben ein bescheidenes Maß an Hybridisierung zwischen Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus von ~8 % in den nördlichen Städten der USA (Chicago, IL und New York, NY)30,50. In Südeuropa, wo Cx. p. pipiens und Cx. p. molestus beide oberirdisch vorkommen, war der Hybridisierungsgrad zwischen ihnen ähnlich und wurde auf 8-10 % geschätzt51. Ein wesentlich höherer Hybridisierungsgrad wurde in südlichen Populationen im Osten der USA festgestellt, wo ~40 % aller Proben als Hybride zwischen Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens identifiziert wurden19. Somit waren die Hybridisierungsraten zwischen den Mitgliedern von Cx. pipiens in Nordamerika insgesamt höher als in der Alten Welt. Zum Vergleich: Die Hybridisierung zwischen kryptischen Arten des An. gambiae-Komplexes (An. gambiae und An. coluzzi) schwankte signifikant zwischen 1 % in Mali46 und >20 % in Guinea Bissau52, was vergleichbar ist mit den allgemeinen Hybridisierungsraten zwischen Cx. p. molestus und Cx. p. pipiens.

Interessanterweise konnten wir in unserer Studie in keiner einzigen Cx. p. molestus-Probe aus der Republik Belarus, der Kirgisischen Republik und Chicago, IL, USA, eine Cx. p. pipiens-Beimischungssignatur feststellen (Abb. 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass es nur einen sehr geringen oder gar keinen Genfluss von Cx. p. pipiens zu Cx. p. molestus gibt. Ähnliche Befunde einer asymmetrischen Introgression von Cx. p. molestus zu Cx. p. pipiens wurden in früheren Studien gezeigt20,51. Der Mechanismus der asymmetrischen Introgression ist derzeit noch unbekannt. Eine Hypothese besagt, dass Männchen von Cx. p. molestus, die sich auf engem Raum paaren können, sowohl mit Cx. p. molestus- als auch mit Cx. p. pipiens-Weibchen hybridisieren können. Im Gegensatz dazu können Cx. p. pipiens-Männchen, die Platz zum Schwärmen benötigen, eine höhere Bereitschaft haben, sich mit Cx. p. pipiens-Weibchen zu paaren51. Zur Erklärung dieses Phänomens sind jedoch weitere populationsgenetische und experimentelle Studien erforderlich.

Schließlich hat unsere Studie gezeigt, dass Cx. p. pipiens durch adaptive Introgression des genetischen Materials von Cx. p. molestus eine Autogenese entwickeln kann. In den im Feld gesammelten Proben aus ober- und unterirdischen Umgebungen in Washington, D.C., USA, wählten wir Mücken für die Autogenese aus. Die unterirdischen Stechmücken waren autogen, die oberirdischen hingegen anautogen. Die Mücken aus den autogenen und anautogenen Kolonien bildeten jedoch einen einzigen Cluster, als die Nachbarschaftsanalyse angewendet wurde (Abb. 2). Darüber hinaus wurden diese Proben durch PCA (Abb. 3) und ADMIXTURE (Abb. 4) mit Cx. p. pipiens von anderen Standorten geclustert. Populationen mit gemischten Merkmalen wurden in Europa51 und in den USA53 gefunden. In Portugal wurde bei Cx. p. molestus54 auch ein ungewöhnliches Muster des Blutfressverhaltens an Vögeln festgestellt.

Das Vorhandensein einer fortlaufenden Hybridisierung zwischen Mitgliedern des Cx. pipiens-Komplexes deutet also darauf hin, dass der Speziationsprozess zwischen ihnen noch nicht abgeschlossen ist und die postzygotischen Barrieren der reproduktiven Isolation noch nicht vollständig ausgebildet sind. Insgesamt sind wir der Meinung, dass die Mitglieder des Cx. pipiens-Komplexes ein bemerkenswertes Modell für die Untersuchung verschiedener Aspekte der geografischen und ökologischen Speziation angesichts des anhaltenden Genflusses zwischen ihnen und der lokalen Anpassungen an unterschiedliche Umgebungen darstellen.