Gelfiltrationschromatographie

Gel-Filtrationschromatographie Anwendungen

Die Gelfiltrationschromatographie, eine Art der Größenausschlusschromatographie, kann verwendet werden, um entweder Moleküle und Komplexe in einer Probe in Fraktionen mit einem bestimmten Größenbereich zu fraktionieren, um alle Moleküle, die größer als eine bestimmte Größe sind, aus der Probe zu entfernen oder um eine Kombination aus beiden Verfahren durchzuführen. Die Gelfiltrationschromatographie kann zur Trennung von Verbindungen wie kleinen Molekülen, Proteinen, Proteinkomplexen, Polysacchariden und Nukleinsäuren in wässriger Lösung verwendet werden. Wenn ein organisches Lösungsmittel als mobile Phase verwendet wird, wird das Verfahren stattdessen als Gelpermeationschromatographie bezeichnet.

Die Gelfiltrationschromatographie kann auch verwendet werden für:

• Fraktionierung von Molekülen und Komplexen innerhalb eines vorbestimmten Größenbereichs
• Größenanalyse und -bestimmung
• Entfernung von großen Proteinen und Komplexen
• Pufferaustausch
• Entsalzung
• Entfernung von kleinen Molekülen wie Nukleotiden, Primern, Farbstoffen, und Verunreinigungen
• Bewertung der Probenreinheit
• Trennung von gebundenen von ungebundenen Radioisotopen

Gelfiltrations-Chromatographiemedien für alle oben genannten Verwendungszwecke sind als vorgepackte Schwerkraftflusssäulen, Spin-Säulen, Niederdruck- und Mitteldruck-Chromatographiesäulen sowie als Flaschenharze erhältlich.

Mechanismus der Gelfiltrationschromatographie

In einer Gelfiltrationschromatographiesäule besteht die stationäre Phase aus einer porösen Matrix, und die mobile Phase ist der Puffer, der zwischen den Matrixkügelchen fließt. Die Perlen haben einen bestimmten Porengrößenbereich, der als Fraktionierungsbereich bezeichnet wird. Moleküle und Komplexe, die zu groß sind, um in die Poren einzudringen, bleiben in der mobilen Phase und bewegen sich mit dem Pufferfluss durch die Säule. Kleinere Moleküle und Komplexe, die in die Poren eindringen können, gelangen in die stationäre Phase und bewegen sich auf einem längeren Weg durch die Poren der Perlen durch die Gelfiltrationssäule.

Jedes Molekül oder jeder Komplex, das bzw. der oberhalb des Fraktionierungsbereichs für eine bestimmte Gelfiltrationschromatographiesäule liegt, bewegt sich schneller durch die Säule als jedes Molekül, das in die stationäre Phase eindringen kann. Daher eluiert jeder Bestandteil der Probe, der oberhalb des Fraktionierungsbereichs liegt, zuerst (im Leervolumen) vor allem, was innerhalb des Fraktionierungsbereichs liegt. Die Mindestgröße, die in der mobilen Phase verbleibt und nicht in die stationäre Phase gelangt, wird als Ausschlussgrenze bezeichnet. Bio-Rad bietet Gelfiltrationschromatographiemedien und -säulen mit Ausschlussgrenzen an, die über drei Größenordnungen reichen, von 100 Dalton bis 100.000 Dalton (100 kDa).

Moleküle und Komplexe, die in die stationäre Phase eintreten können, werden entsprechend ihrer Größe fraktioniert. Kleinere Moleküle wandern tief in die Poren ein und werden stärker verzögert als größere Moleküle, die nicht so leicht in die Poren eindringen können und daher schneller aus der Säule eluiert werden. Dieser Unterschied in der Porenwanderung führt zu einer Fraktionierung der Komponenten nach Größe, wobei die größten zuerst eluiert werden.

In Gelfiltrationschromatographiesäulen, die für Entsalzung, Pufferaustausch und die Entfernung kleiner Moleküle wie Nukleotide ausgelegt sind, treten die Salze und kleinen Verbindungen leicht in die Poren ein, werden verzögert und wandern langsamer durch die Säule als die größeren Proteine oder Nukleinsäuren. Daher werden die interessanten Bestandteile der Probe vor den Salzen, Nukleotiden usw. eluiert. DNA-Reinigungskits, die diesen Mechanismus verwenden, enthalten häufig Gelfiltrations-Spinsäulen.

Die Auflösung, hier definiert als die Schärfe der Grenzen zwischen den Größenfraktionen, wird durch die Beadgröße und eine Reihe anderer Faktoren bestimmt. Eine geringere Perlengröße führt im Allgemeinen zu einer höheren Auflösung in einer Gelfiltrationschromatographiesäule. Kompakte Moleküle diffundieren schneller durch die stationäre Phase als lineare Moleküle. Größenausschluss, Fraktionierungsbereich und Elutionsgeschwindigkeit werden von der Pufferzusammensetzung, der Ionenstärke und dem pH-Wert beeinflusst. Für die Fraktionierung komplexer Proteingemische müssen Elutionszeiten und Größenausschlussgrenzen unter Umständen empirisch bestimmt werden.

Gelfiltrations-Chromatographiemedien

Ein wichtiges Kriterium für Gelfiltrations-Chromatographiemedien ist, dass die Medien inert sind und dass nichts in der Probe oder im Puffer an die Medien gebunden wird. Ein weiterer Gesichtspunkt ist die Art der verwendeten Gelfiltrationssäule und ob sie in einem Druckchromatographiesystem oder in einer Schwerkraft- oder Spin-Säule verwendet wird. Wenn ein Druckchromatographiesystem verwendet wird, müssen sowohl die Säule als auch das Medium dem Druck und den Durchflussraten standhalten.

Gemeinsam verwendete Medien für die Gelfiltrationschromatographie basieren auf Agarose- oder Polyacrylamid-Perlen, Dextrose für Schwerkraft- oder Niederdrucksysteme und Polymerharze für Mitteldrucksysteme. Die Wahl des Mediums hängt von den Eigenschaften der zu trennenden Komponenten und anderen experimentellen Faktoren ab. Im Folgenden werden allgemeine Überlegungen zur Auswahl von Gelfiltrationschromatographiemedien angestellt:

• Fraktionsbereich
• Größenausschlussgrenze
• Betriebsdruck
• Durchflussrate
• Probenviskosität
• pH-Bereich
• Autoklavierbarkeit
• Toleranz für mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel; einige Proben können in einem Wasser-Organik-Gemisch besser löslich sein
• Toleranz für Detergenzien, Chaotropiermittel, Formamid usw.
• Betriebstemperatur

Die Art der Proben, die Wahl der Medien und der Aufbau des Chromatographiesystems bestimmen, welche Parameter für eine bestimmte Reinigungsanwendung am wichtigsten sind.