Gamma-Glutamyl Transpeptidase

Aktivität und Spezifität

Die von diesem Enzym katalysierte Reaktion wird daher im Allgemeinen als Übertragung einer γ-Glutamylgruppe auf eine Vielzahl von Akzeptormolekülen wie Wasser, Aminosäuren, Dipeptide und den γ-Glutamyl-Donor selbst verstanden, abhängig von den Reaktionsbedingungen. Diese katalytischen Eigenschaften stehen im Zusammenhang mit dem katalytischen Mechanismus von GGT, bei dem die Reaktion durch einen Acylierungs-Desacylierungs-Doppelverschiebungsmechanismus über ein γ-Glutamyl-Enzym-Zwischenprodukt abläuft.

Wie aus den Strukturen des natürlichen Substrats Glutathion und seiner Derivate zu erwarten, erkennt GGT strikt die γ-Glutamylgruppe, hat aber eine ziemlich breite Substratspezifität in Bezug auf die Abgangsgruppe (Xaa). Glutathion, seine S-Konjugate, Glutathiondisulfid, γ-Glutamyl-Di- oder -Tripeptide, Glutamin, l-α-Methylderivate von γ-Glutamylamiden, Leukotrien C4, Poly-γ-Glutamylderivate werden als Substrate akzeptiert. Künstliche Substrate wie l-γ-Glutamyl-p-nitroanilid (l-γ-Glu-pNA) und fluoreszierendes l-γ-Glutamyl-7-amino-4-methylcumarin (l-γ-Glu-AMC) sind aktive Substrate, die üblicherweise in Gegenwart oder Abwesenheit von γ-Glutamyl-Akzeptoren (siehe unten) für Transpeptidase- bzw. Hydrolase-Tests verwendet werden.

Die Substratspezifität in Bezug auf den Akzeptor ist am ausführlichsten mit GGT aus Rattennieren untersucht worden. Die l-Isomere neutraler Aminosäuren wie l-Cystin, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys und l-Ser sind gute Akzeptoren, aber hydrophobe und verzweigtkettige Aminosäuren wie l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile und l-Val sind eher schlechte Substrate. d-Aminosäuren und α-substituierte Aminosäuren wirken nicht als Akzeptorsubstrate. Daher ist die Verwendung von d-γ-Glu-pNA eine geeignete Methode zur Unterdrückung der Autotranspeptidierung bei der Messung der Hydrolaseaktivität. Da sich die Akzeptor-Bindungsstelle mit den Teilstellen für den Cys-Gly-Anteil von Glutathion überschneidet, bevorzugt das Enzym die Dipeptide mit Gly am C-Terminus wie l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-Cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly und l-Ser-Gly als Akzeptor-Substrate in absteigender Reihenfolge der relativen Aktivität. Die Peptide mit mehr als zwei Aminosäureresten sind sehr schlechte Akzeptoren. Die Km-Werte für die Akzeptor-Aminosäuren und Dipeptide sind relativ hoch und liegen im Bereich von 0,1 bis 5 mM , wobei Gly-Gly (Km=3 mM) am besten als Akzeptorsubstrat für die Transpeptidase-Aktivität geeignet ist. Hohe Konzentrationen von Akzeptormolekülen hemmen GGT kompetitiv gegenüber dem γ-Glutamyl-Donor (γ-Glu-Xaa), was wahrscheinlich auf die Überlappung der Bindungsstelle für Xaa und die für den Akzeptor zurückzuführen ist. Die Substratspezifität in Bezug auf den Cys-Teilbereich hängt von der Herkunft des Enzyms ab; das E. coli-Enzym bevorzugt beispielsweise basische Aminosäuren (l-Arg, l-Lys und l-His) und aromatische Aminosäuren (l-Phe, l-Trp und l-DOPA) an dieser Stelle. Die Akzeptorspezifität ist jedoch mit Vorsicht zu genießen, da die scheinbare Aktivität auch von der effektiven Konzentration der deprotonierten Aminosäure abhängt, die bei dem betreffenden pH-Wert verfügbar ist. Die bei Gly-Gly beobachtete relativ hohe Aktivität ist zum Teil auf den niedrigen pKa-Wert dieses Dipeptids zurückzuführen. Deprotonierte Aminogruppen von Akzeptorsubstraten scheinen für die Transpeptidierung erforderlich zu sein.

Das am häufigsten verwendete Donorsubstrat für Enzymtests ist l-γ-Glu-pNA. Eine typische Testmischung für die Transpeptidaseaktivität des Rattennierenenzyms besteht aus 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) bei 25°C. Die Zugabe einer ausreichenden Konzentration von Gly-Gly unterdrückt wirksam die Hydrolyse und Autotranspeptidierung. Der optimale pH-Wert von GGT liegt bei etwa 7,5-9 für die Transpeptidierung, aber die pH-Abhängigkeit ist für die Hydrolyse viel geringer. Dies steht im Einklang mit der Tatsache, dass die offensichtliche Transpeptidaseaktivität zum Teil von der effektiven Konzentration der freien Aminogruppe der Akzeptoren abhängt.

Die Hydrolaseaktivität für Glutamin wird durch Zugabe von Akzeptorstellen-gerichteten Modulatoren wie Maleat, Hippurat und Glycocholat um das bis zu 12-fache erhöht. Die Zugabe dieser Verbindungen hemmt die Bindung von Akzeptorsubstraten und den γ-Glutamyl-Donatoren, die die Cys-Gly-Subsites besetzen. Die Zugabe von γ-Glutamyl-Donatoren oder die Bindung von Inhibitoren an der γ-Glutamyl-Donatorstelle erhöht die Affinität dieser Modulatoren, was auf kooperative Wechselwirkungen zwischen den Bindungsstellen für γ-Glutamyl-Donatoren und -Akzeptoren hindeutet (für eine Übersicht siehe Tate & Meister ). Es wird angenommen, dass die von diesen Modulatoren besetzte Akzeptorstelle eine Konformationsänderung von GGT in eine aktive Form fördert und dadurch die Bildung eines Übergangszustands erleichtert. Dies wird auch als Erklärung für die Erhöhung der Inaktivierungsrate von Säugetierenzymen durch Acivicin vorgeschlagen (vide infra), was jedoch bei der Hemmung durch ein γ-Monofluorophosphonat, einem auf die aktive Stelle gerichteten Übergangszustandsanalogon, nicht beobachtet wurde. Acivicin scheint an einen anderen nukleophilen Rest als das katalytische Nukleophil der Säugetier-GGT zu binden.

GGT wird reversibel und kompetitiv durch l- und d-γ-Glutamyl-(o-carboxy)phenylhydrazid (Anthglutin, hergestellt von Penicillium oxalicum) mit einem Ki von 8 μM gehemmt, und es wird keine akute Toxizität für Mäuse berichtet. Mehrere Glutamatanaloga mit einer reaktiven Gruppe in der Nähe der γ-Carboxygruppe wirken als irreversible Inhibitoren. 6-Diazo-5-oxo-l-norleucin (DON), O-Diazoacetyl-l-serin (l-Azaserin) und l-(αS,5S)-α-Amino-3-chlor-4,5-dihydro-5-isoxazolessigsäure (Acivicin oder AT-125, hergestellt von Streptomyces sviceus) sind potente, aber unspezifische Inaktivatoren der GGT. Acivicin wurde in großem Umfang zur Unterdrückung der Aktivität der GGT in vivo eingesetzt, obwohl Acivicin hochtoxisch ist, da es eine Reihe von Glutamin-Amidotransferasen inaktiviert, die an der Biosynthese von Nukleotiden, Aminosäuren und Aminozuckern beteiligt sind. Der Serin-Borat-Komplex wird reversibel an die γ-Glutamyl-Bindungsstelle gebunden und hemmt GGT mit einem Ki von 20 μM. Diese klassische Erkenntnis hat zu einem potenten und langsam bindenden Inhibitor geführt, der l-2-Amino-3-boronobutansäure (γ-BoroGlu) . GGT wird mit einem Gesamt-Ki von 17 bzw. 35 nM gehemmt, aber die Hemmung ist dennoch reversibel. 2-Amino-4-(fluorophosphono)butansäure (γ-PFGlu), ein Glutamat-Analogon mit einem elektrophilen Phosphor als Ersatz für die γ-Carboxygruppe, ist ein leistungsfähiges, auf dem Mechanismus basierendes und auf das aktive Zentrum gerichtetes Affinitätsmarkierungsmittel für E. coli GGT . Diese Verbindung hemmt GGT schnell und irreversibel und bildet ein stabiles, anionisches und tetraedrisches übergangszustandsähnliches Addukt, das sich für ein Peptid-Mapping eignet, um das katalytische Nukleophil von E. coli GGT zu identifizieren (vide infra). Eine Reihe von γ-(Monophenyl)phosphono- und γ-Phosphonodiester-Glutamat-Analoga dienen als mechanismusbasierte Inhibitoren, die GGT irreversibel durch kovalente Modifikation seines katalytischen Nukleophils hemmen. Insbesondere die γ-Phosphonodiester, die die strukturelle Nachahmung von Cys-Gly und dessen C-terminale Carboxygruppe enthalten, weisen eine außerordentlich hohe Aktivität gegenüber menschlichem GGT auf, wobei die Inaktivierungsrate 130- bis 6000-mal so hoch ist wie die von Acivicin. Die Hemmung ist selektiv für GGT, und es wird keine Toxizität beobachtet. Einer dieser Inhibitoren ist unter dem Namen „GGsTop“ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) im Handel erhältlich.

Ein nicht glutamatanaloger Inhibitor der menschlichen GGT wurde durch Hochdurchsatz-Screening gefunden. Diese Verbindung besetzt die Akzeptorstelle des γ-Glutamylsubstratkomplexes mit einem Ki von 17,6 μM. Der Inhibitor ist spezies-selektiv, aber reversibel, und es wird über eine gewisse Toxizität berichtet.

Es wird angenommen, dass die von GGT katalysierte Reaktion mit einem Ping-Pong-Mechanismus über ein γ-Glutamyl-Enzym-Zwischenprodukt abläuft, wie es bei Serinhydrolasen beobachtet wird. Das N-terminale Thr Oγ in der kleinen Untereinheit ist das katalytische Nukleophil, an das eine γ-Glutamylgruppe gebunden ist (siehe Strukturchemie). Das katalytische Nukleophil von GGT wurde zum ersten Mal bei E. coli GGT als N-terminaler Thr-Rest (Thr391) in der kleinen Untereinheit durch Peptidkartierung des mit γ-PFGlu inaktivierten Enzyms identifiziert. Dieser Rest, der Thr380 (Rattennierenenzym) und Thr381 (menschliches Enzym) entspricht, ist bei allen GGTs, deren Primärsequenzen bekannt sind, konserviert. Das katalytische Nukleophil der menschlichen GGT wurde durch Peptidkartierung des durch die γ-(Monophenyl)phosphono-Affinitätsmarke inaktivierten Enzyms als Thr381 identifiziert. Die von GGT katalysierte Reaktion beginnt also mit dem nukleophilen Angriff des N-terminalen Thr-Rests in der kleinen Untereinheit auf das γ-Carboxy eines Donorsubstrats (γ-Glu-Xaa), um Xaa zu eliminieren. Das so gebildete γ-Glutamyl-Enzym reagiert im geschwindigkeitsbestimmenden Schritt mit Wasser (Hydrolyse) oder mit Aminosäuren und Dipeptiden (Transpeptidierung und Autotranspeptidierung).

GGT ist ein Mitglied der N-terminalen nukleophilen Hydrolasen (Ntn-Hydrolasen), wie aus seiner einzigartigen Faltung und dem Reifungsprozess vorhergesagt wird, bei dem eine aktive dimere Form des reifen Enzyms durch posttranslationale autokatalytische Prozessierung des katalytisch inaktiven Vorläufers erzeugt wird. Dies wird durch ortsgerichtete Mutagenese und die Röntgenstrukturanalyse bakterieller Enzyme bestätigt (siehe Strukturchemie).