Furin

Die ubiquitären Konvertasen Furin, PC7 und SKI-1/S1P

Furin, ein ubiquitäres Membranprotein, wird zunächst als ∼104-kDa-Vorläufer produziert und rasch in eine aktive ∼98-kDa-Form umgewandelt. Diese autokatalytische Spaltung, die im ER stattfindet, ist eine Voraussetzung für den Austritt reifer Furinmoleküle aus dem ER zum TGN und zur Zelloberfläche. Furin und PC5/6 scheinen eine teilweise Redundanz ihrer in vitro-Spaltungsselektivität für eine Reihe von Substraten und eine Empfindlichkeit gegenüber bestimmten modifizierten Serpin-Inhibitoren wie α1-PDX oder deren Prosegmenten aufzuweisen (Abb. 6). Die verschiedenen Arten von konstitutiv sezernierten Proteinen, die von den Furin-ähnlichen Konvertasen verarbeitet werden, sind in Tabelle 1 beispielhaft aufgeführt. Im Zentralnervensystem ist Furin für die Prozessierung einer Reihe von Wachstumsfaktoren verantwortlich, darunter die Neurotrophine Pro-Nerve Growth Factor (NGF) und Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF), sowie neuronale Zelladhäsions- und Cueing-Proteine wie L1-CAM und Semaphorine.

Die Inaktivierung des Furin-Gens (Fur) in Mäusen ist letal, wobei der Tod am Embryonaltag 10,5-11 (E10,5-E11) aufgrund von hämodynamischer Insuffizienz und kardialen ventralen Verschlussdefekten eintritt. Die mutierten Embryonen entwickeln trotz des Vorhandenseins von Endothelzellvorläufern keine großen Gefäße. Es hat sich gezeigt, dass der transformierende Wachstumsfaktor β1 effizient von Furin verarbeitet wird, und die Inaktivierung seines Gens führt zu einem ähnlichen Phänotyp wie bei Furin-Null-Embryonen. Ein konditionaler Knockout in der Leber, bei dem die Deletion von Exon 2 von der Cre-Expression des Mx1-cre-Transgens abhängt, führte zu lebensfähigen Furflox/flox Tg(Mx1-cre)-Mäusen mit fast keinem Phänotyp. Dies zeigte eine gewisse Redundanz mit anderen PC, da einige typische Furin-Substrate in geringerem Maße gespalten wurden.

Im Gegensatz zu den anderen PC-Null-Mäusen zeigten mehrere Studien an PC7-Null-Mäuse-Embryonen keinen offensichtlichen abnormalen Phänotyp unter Ruhebedingungen. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass sich die PC7-Expression weitgehend mit der von Furin überschneidet. Viele Berichte zeigen, dass PC7 und Furin die gleichen Substrate verarbeiten, wie PDGF-AA, PDGF-BB, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor C und morphogenes Knochenprotein. Möglicherweise ist die am meisten konservierte Konvertase PC7 auch an der Verarbeitung einer Reihe von nicht essenziellen Substraten beteiligt. Eine sorgfältige Analyse von PC7 KO in Mäusen ergab jedoch Verhaltensanomalien, die mit einem Überschuss an Dopamin und einem teilweisen Verlust der proBDNF-Aktivierung zu BDNF in der Amygdala und im Hippocampus zusammenhängen. Dazu gehörte der Verlust von Angstgefühlen und emotionalem Gedächtnis, was darauf hindeutet, dass PC7 in vivo eine Rolle bei der Regulierung bestimmter Arten von kognitiven Leistungen spielt, teilweise über die Verarbeitung von pro-BDNF. Menschliche GWAS und biochemische Studien ergaben, dass PC7 eine Sheddase des membrangebundenen Transferrinrezeptors in eine lösliche zirkulierende Form ist, was die Rolle von PC7 im Eisenstoffwechsel unterstreicht.

SKI-1/S1P ist ein Schlüsselenzym bei der Regulierung des Lipidstoffwechsels und der Cholesterinhomöostase, das die Transkriptionsfaktoren sterol regulatory element binding proteins (SREBP-1 und SREBP-2) spaltet. Letztere werden als Vorläufer synthetisiert, die zwei Transmembrandomänen enthalten, die durch eine kurze ER-Luminalschleife getrennt sind und N- und C-terminale zytosolische Domänen umfassen. Diese Vorstufen werden in Abhängigkeit vom SREBP-aktivierenden Protein (SCAP) und dem Insulin-induzierten Gen (Insig) gespalten. Wenn der Cholesterinspiegel in der Zelle hoch ist, binden die Insulin-regulierten Proteine Insig-1 und/oder Insig-2 den SCAP-SREBP-Komplex und halten ihn im ER fest. Wenn den Zellen Sterine entzogen werden, trennen sich die Insigs und ermöglichen den Transport des SREBP-SCAP-Komplexes zum Golgi-Apparat. Dort findet ein zweistufiger proteolytischer Prozess statt, der mit SKI-1/S1P an der Sequenz R-X-V-L↓ (Abb. 2) und dann die Site-2-Protease (S2P) die zytosolischen N-terminalen Segmente der SREBPs aus den Zellmembranen freisetzt und ihre Translokation in den Zellkern (nSREBP) ermöglicht, wo sie die Transkription von mehr als 35 mRNAs aktivieren, die für die Proteine/Enzyme kodieren, die für die Biosynthese und Aufnahme von Cholesterin und ungesättigten Fettsäuren sowie den Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) erforderlich sind.

Ähnlich wie die SREBPs spielt der membrangebundene Typ-II-Transkriptionsfaktor ATF6, der im ER verankert ist, eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf ungefaltete Proteine. Unter normalen Bedingungen wird er durch das Chaperon BIP im ER gehalten, wobei seine N-terminale DNA-Bindungsdomäne dem Zytosol zugewandt ist und sein COOH-Terminus sich im ER-Lumen befindet. Die Anhäufung von falsch gefalteten Proteinen im ER, die durch Kalziumentzug (Thapsigargin) oder Hemmung der N-Glykosylierung (Tunicamycin) ausgelöst werden kann, führt zu einer ER-Stressreaktion, die zur Dissoziation von BIP und proATF6 führt. Letzteres wird dann SCAP-unabhängig in den Golgi transloziert, wo es zunächst von SKI-1 und dann von S2P gespalten wird. Dadurch wird die zytosolische N-terminale Domäne freigesetzt, die in den Zellkern gelangt (nATF6), um ER-Stress-Zielgene zu aktivieren.

Zu den anderen membrangebundenen Substraten vom Typ II gehören mindestens sechs CREB-ähnliche Transkriptionsfaktoren mit basischem Leuzin-Zipper. SKI-1/S1P SKI-1/S1P spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Biogenese von Lysosomen, und zwar durch seine Fähigkeit, die α/β-Untereinheit-Vorstufe der GlcNAc-1-Phosphotransferase zu aktivieren, ein Komplex, der für die Sortierung vieler Hydrolasen in Lysosomen entscheidend ist. BDNF ist ein lösliches Substrat, und die Untersuchung seiner Verarbeitung führte zur ersten Klonierung von SKI-1. Wir haben auch gezeigt, dass das lösliche Pro-Somatostatin von SKI-1 gespalten wird, um das N-terminale Peptid Antrin freizusetzen.

Die wesentliche Rolle von SKI-1/S1P wird aus der Tatsache ersichtlich, dass die Deletion seines Gens zum embryonalen Tod in den frühesten Stadien der Zellteilung führt (d.h. vom Ein- bis zum Zwei-Zell-Stadium) und somit die Bildung von Blastozysten verhindert. Bei der Verwendung von gewebespezifischen Knockout-Mäusen in der Leber wurde der Spiegel des zirkulierenden Gesamtcholesterins um 50 % gesenkt, was die kritische Kontrolle der Cholesterinsynthese und -aufnahme unterstreicht. Die Unterdrückung der SKI-1/S1P-Expression, insbesondere in Chondrozyten (3.6 Col1-Cre), führte zu schweren Lähmungen der unteren Gliedmaßen, einem verkürzten Schwanz und zusätzlichen Lendenwirbeln. Im Gegensatz dazu wurde ein Cross-Talk zwischen Knochen und Muskeln aufgedeckt, als SKI-1/S1P in Osteozyten zum Schweigen gebracht wurde, da dies zur Stimulierung der Regeneration des Soleus-Muskels und zur Steigerung der Größe und der kontraktilen Muskelkraft im Alter führte. Die entscheidende Bedeutung dieses Enzyms im Zentralnervensystem wurde durch eine Studie über die Verarbeitung des repulsiven Leitmoleküls (RGMa) durch SKI-1/S1P und Furin deutlich, die ihre Beteiligung am Axonalwachstum aufdeckte und zeigte, dass die RGMa-Spaltung für die Neogenin-vermittelte Wachstumshemmung von wesentlicher Bedeutung ist. Das SKI-1/S1P-Gen (MBTPS1) ist nicht polymorph, und bisher wurde keine einzelne polymorphe Nukleotidvariation identifiziert, die genetisch mit einer bekannten Pathologie in Verbindung gebracht werden könnte. Dies unterstreicht wahrscheinlich die Notwendigkeit, mehr als 80 % seiner Aktivität zu eliminieren, bevor ein Phänotyp auftritt, und die Letalität, die mit seinem vollständigen Funktionsverlust einhergeht.