Frontiers in Physiology

Einführung

Das HUMAN GENOME-Projekt hat unser Verständnis der Grundeinheit der genetischen Information verändert, wobei sich die RNA als vielseitiger Regulator zentraler zellulärer Prozesse herausgestellt hat (Thum und Condorelli, 2015). Die nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs), Transkripte, die nicht für Proteine kodieren, bilden die größte Klasse und werden willkürlich in kleine (<200 Nukleotide) und lange nicht-kodierende RNAs (lncRNA (>200 Nukleotide) unterteilt. MicroRNAs (miRNAs) sind die am besten untersuchten kleinen ncRNAs und stellen eine zusätzliche Schicht posttranskriptioneller Regulatoren dar, die Störungen auffangen und die Robustheit biologischer Systeme gewährleisten (Liu und Olson, 2010; Ebert und Sharp, 2012; Rotllan et al., 2016).

Es wurden inzwischen erhebliche Anstrengungen unternommen, um die Funktion von lncRNAs zu entschlüsseln. Im kardiovaskulären System spielen lncRNAs Berichten zufolge eine Schlüsselrolle in der Physiologie und bei Krankheiten, und es wurde erforscht, wie sich lncRNAs für neuartige therapeutische Interventionen nutzen lassen (Uchida und Dimmeler, 2015; Boon et al., 2016; Buhrke et al., 2018). Hier werden wir die experimentellen Werkzeuge zur Bestimmung der RNA-Struktur erörtern, die einzigartige Einblicke in die lncRNA-Funktion im kardiovaskulären System bieten können.

Herausforderungen bei der Bewertung der lncRNA-Funktionalität

Die einzigartigen Merkmale von lncRNA wurden umfassend untersucht (Guttman und Rinn, 2012; Ulitsky und Bartel, 2013; Bar et al., 2016; Ulitsky, 2016). Mehrere Eigenschaften von lncRNAs machen eine funktionelle Bewertung schwierig. Typischerweise weisen lncRNAs eine geringe Erhaltung über verschiedene Arten hinweg auf und zeigen nur „Flecken“ konservierter Basen, die von großen, scheinbar unbehinderten Sequenzen umgeben sind (Ponjavic et al., 2007; Guttman et al., 2009; Necsulea et al., 2014; Washietl et al., 2014). Darüber hinaus weisen lncRNAs eine geringe Abundanz auf, die ihre Wirkungsweise und -orte einschränkt (Mercer et al., 2008; Cabili et al., 2011, 2015; Washietl et al., 2014; Ulitsky, 2016; Wilk et al., 2016; Jandura und Krause, 2017). In Bezug auf die Funktionsweise sind sowohl cis- als auch trans-regulatorische Aktivitäten beschrieben worden (Mercer und Mattick, 2013). Als cis-Regulatoren üben lncRNAs ihre Funktion auf benachbarte Gene auf demselben Allel aus, von dem sie transkribiert werden, und zeigen eine Korrelation und Störung der Expression auf allelspezifische Weise. CARMEN, eine Enhancer-assoziierte lncRNA und ein entscheidender Regulator der kardialen Spezifikation in menschlichen Herzvorläuferzellen, wirkt nachweislich in cis, um die Expression von miR-143/145 zu kontrollieren (Ounzain et al., 2015). Andererseits können trans-lncRNAs die Genexpression in einer Entfernung von ihrer Transkriptionsstelle steuern, indem sie den Chromatinzustand verändern, die Kernstruktur beeinflussen oder die Proteinfunktion regulieren (Vance und Ponting, 2014; Kopp und Mendell, 2018).

Interessanterweise scheint bei einigen lncRNAs mit geringer Häufigkeit der Akt der Transkription wichtiger zu sein als das Transkript selbst. In einer bahnbrechenden Studie haben Engreitz et al. (2016) 12 genomische Loci, die lncRNAs produzieren, genetisch manipuliert und festgestellt, dass 5 Loci die Expression eines benachbarten Gens in cis beeinflussen. Die Expression der lncRNAs-Transkripte selbst war nicht erforderlich, stattdessen waren Prozesse, die mit ihrer Transkription verbunden sind, entscheidend (Engreitz et al., 2016).

Das RNA-Interaktom

Die oben genannten funktionellen Vielseitigkeiten von lncRNAs rühren von ihrer Fähigkeit her, unterschiedliche Strukturen und molekulare Interaktionen mit Proteinen, RNA und DNA zu bilden (Guttman und Rinn, 2012; Marchese et al., 2017). In Ribonukleoprotein-Komplexen (RNPs) können lncRNAs als Gerüste fungieren, um die Komplexe zu stabilisieren und sie an spezifische subzelluläre Orte oder die DNA zu lenken. In Endothelzellen verleiht die Interaktion der lncRNA MANTIS mit den katalytischen Untereinheiten der ATPase dem SWI/SNF-Chromatinumbaukomplex (switch/sucrose non-ferentable) Spezifität, indem sie ihn zu einer Untergruppe angiogener Gene lenkt und den Nukleosomenumbau und die Transkriptionsinitiierung erleichtert (Leisegang et al., 2017; Zampetaki und Mayr, 2017). Tatsächlich ist die Bindung von lncRNAs an spezifische ATPase-Untereinheiten des SWI/SNF-Komplexes ein gängiger Regulationsmechanismus (Cajigas et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Die Interaktion von lncRNAs mit Chromatinkomplexen ist besonders wichtig, da diese lncRNA-RNPs Chromatinmodifikationen durch Interferenz mit der chromatinmodifizierenden Maschinerie auslösen können (Tsai et al., 2010; Brockdorff, 2013; Simon et al., 2013). Im Herzen wirkt Chaer, eine mit Herzzellen angereicherte lncRNA, als epigenetischer Schalter, indem sie mit dem Polycomb Repressiven Komplex 2 (PRC2) interferiert und H3K27m3 bei Genen hemmt, die an der Herzhypertrophie beteiligt sind (Wang et al., 2016), während die den Mesoderm-Glauben bestimmende lncRNA Fendrr sowohl an den PRC2- als auch an den Trithorax-Gruppe/MLL-Komplex (TrxG/MLL) binden kann und so als Feinabstimmer fungiert (Grote et al., 2013).

Neben Proteinen wurde auch die Interaktion von lncRNAs mit DNA beschrieben. Dies kann zur Bildung von RNA-DNA Triplex führen, einer Struktur, die in vivo weit verbreitet ist und die Erkennung von Zielgenen durch lncRNAs erleichtert (Mondal et al., 2015). Diese Interaktion wurde bei MEG3, einer mit Herzfibroblasten angereicherten lncRNA, die Fibrose fördert, auf elegante Weise nachgewiesen (Piccoli et al., 2017). MEG3 interagiert mit dem PRC2-Komplex und bildet über GA-reiche Sequenzbindungsstellen RNA-DNA-Triplexstrukturen. Chromatin-RNA-Immunpräzipitation ergab, dass MEG3 die Aktivität von Genen des TGF-b-Signalwegs moduliert und die Zielerkennung über die Triplex-Strukturen erfolgt (Mondal et al., 2015).

Die regulatorischen Funktionen von langen nicht-kodierenden RNAs beruhen ebenfalls auf RNA-RNA-Interaktionen. Durch das Zusammenspiel mit miRNAs entsteht ein komplexes Netzwerk, das eine posttranskriptionelle Regulierung der Genexpression ausübt. LncRNAs können miRNA-Bindungsstellen beherbergen und als molekulare Köder oder Schwämme fungieren, die miRNAs von anderen Transkripten absondern. Es wurde berichtet, dass lncRNAs und miRNAs um die Bindung an Ziel-mRNAs konkurrieren und zu einer Depression der Genexpression führen (Yoon et al., 2014; Ballantyne et al., 2016). Schließlich können lncRNAs eingebettete miRNA-Sequenzen enthalten und als Quelle für miRNAs dienen (Piccoli et al., 2017).

Linking RNA Structure to Function

RNA-Moleküle nehmen tertiäre Wechselwirkungen höherer Ordnung an (Staple und Butcher, 2005; Wan et al., 2011). Obwohl sich Verbindungen zwischen Struktur und Funktion abzeichnen, sind die strukturellen Domänen, die das RNA-Interaktom dominieren, noch immer nicht gut definiert. Die funktionellen Auswirkungen der Transkriptstruktur werden bei der Verarbeitung der primären miRNAs (primiRNAs) zu reifen miRNAs besser verstanden. Mithilfe mehrerer Mutagenese-Assays wurden die Sekundärstrukturen wie Stammlänge, Haarnadelpaarung, Größe und Position der Ausbuchtung sowie die Größe der apikalen Schleife, die zur effektiven miRNA-Biogenese beitragen, definiert (Auyeung et al., 2013; Fang und Bartel, 2015; Nguyen et al., 2015; Roden et al., 2017). Bei geclusterten miRNAs, die aus mehreren miRNA-Genen bestehen, wurde auch vorgeschlagen, dass die Tertiärstruktur zur Verarbeitung zu einzelnen reifen miRNAs beiträgt. Es wurde gezeigt, dass die Tertiärstruktur des miR-17∼92-Clusters eine autoregulatorische Rolle bei seiner Reifung und der Bindung von Hilfsfaktoren an konservierte Endschleifen spielt (Chakraborty et al., 2012). Kürzlich wurde berichtet, dass im miR-497∼195-Cluster Mutationen in der miR-195a-Haarnadel die Verarbeitung von miR-497a beeinträchtigen, das sich im selben Cluster befindet. Computergestützte Analysen ergaben Unterschiede in der Tertiärstruktur der primiRNA in den Mutanten, die den Reifungsprozess beeinflussen können (Lataniotis et al., 2017). Andererseits fördert die Tertiärstruktur von primiR-30c-1 die Interaktion mit SRSF3, einem Mitglied der SR-Proteinfamilie, das die Erkennung und Verarbeitung von primiRNA erleichtert. Eine einzelne G/A-Sequenzvariation führt zu einer strukturellen Umstrukturierung der apikalen Region der primiRNA, die die konservierten Reste im basalen Teil des Stammes und der reifen miRNA-Generation beeinflusst (Fernandez et al, 2017).

Bei lncRNAs könnte die Selektion, die auf die Struktur und nicht auf die primäre Sequenz wirkt, die schnelle Evolutionsrate erklären, die zur Hypothese des „modularen RNA-Codes“ führte, die auf der Ansicht beruht, dass die Selektion auf strukturelle Domänen wirkt (Wutz et al., 2002; Tsai et al., 2010; Guttman und Rinn, 2012). Einige experimentelle Belege unterstützen dieses Konzept. Das MEG3 lncRNA-Gen enthält drei unterschiedliche Strukturmodule M1, M2 und M3. Deletionsanalysen zeigten, dass die Motive M2 und M3 für die Aktivierung von p53 wichtig sind. Interessanterweise war ein hybrides MEG3-Transkript, bei dem die Hälfte der primären Sequenz im M2-Motiv durch eine völlig unverwandte künstliche Sequenz ersetzt wurde, die eine ähnliche Sekundärstruktur aufwies, bei der Stimulierung der p53-vermittelten Transkription voll funktionsfähig (Zhang et al., 2010).

RNA-Strukturbestimmungsmethoden

Chemische und enzymatische Sondierungsmethoden können ein Verständnis für die Sekundärstruktur von RNA liefern (Ehresmann et al., 1987). Enzymatisches Sondieren stützt sich auf Nukleasen, die an gepaarte und ungepaarte RNA binden und sie verdauen, um RNA-Fragmente zu erzeugen, die analysiert werden können. Beim chemischen Sondieren hingegen werden Chemikalien von geringer Größe verwendet, die reagieren und lösungsmittelzugängliche Nukleotide kovalent modifizieren. Nach der Modifizierung oder Spaltung werden die Positionen in der Regel durch reverse Transkription abgebildet, wodurch die cDNA entweder gestoppt oder eine Mutation eingeführt wird (Wilkinson et al., 2006). Die resultierende cDNA wird dann analysiert, um die Nukleotidposition und die Häufigkeit der Veränderungen zu bestimmen. Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) kann zur direkten Sequenzierung der cDNA-Produkte eingesetzt werden. Dies ermöglicht die Charakterisierung der RNA-Struktur auf transkriptomweiter Ebene in einem einzigen Experiment (Lucks et al., 2011; Incarnato et al., 2014; Loughrey et al., 2014; Rouskin et al., 2014). Obwohl die Technologien ursprünglich für die Analyse der RNA-Struktur in vitro entwickelt wurden, wurde auch über die strukturelle Charakterisierung in vivo berichtet, hauptsächlich durch die Verwendung von Sonden, die schnell durch Membranen diffundieren können (Spitale et al., 2013; Ding et al., 2014; Spitale et al., 2015; Flynn et al, 2016).

Enzymatisches Sondieren

PARS

PARS (Parallele Analyse der RNA-Struktur) ist eine enzymatische Sondierungsmethode mit hohem Durchsatz, die die strukturellen Eigenschaften isolierter polyadenylierter Transkript-Pools misst, die in vitro renaturiert und mit RNase V1 oder S1 behandelt werden. RNase V1 und RNase S1 spalten die 3′-Phosphodiesterbindungen von doppelsträngiger bzw. einzelsträngiger RNA und ermöglichen so die Bewertung der doppel- bzw. einzelsträngigen Konformation (Kertesz et al., 2010).

Frag-Seq

Frag-Seq (Fragmentierungssequenzierung) ist eine enzymatische Methode, bei der eine Nuklease P1 verwendet wird, um spezifisch einzelsträngige RNA zu spalten. Die erzeugten Fragmente werden dann mittels Hochdurchsatzsequenzierung analysiert. Dieser Arbeitsablauf liefert ein „RNA-Zugänglichkeitsprofil“, das mit den DNase-Hypersensitivitäts-Assays für Chromatin vergleichbar ist (Underwood et al., 2010). Bemerkenswert ist, dass Frag-seq Fragmente <200 Basen nach der RNase P1-Spaltung isoliert, weshalb große RNAs möglicherweise unterrepräsentiert sind. Da Frag-seq und PARS komplementäre Daten liefern können, könnte ein kombinierter Ansatz die Genauigkeit von genomweiten RNA-Strukturmessungen verbessern (Wan et al, 2011).

Chemical Probing

DMS Probing

Dimethylsulfat (DMS) ist ein basenspezifisches Reagenz, das den Methylierungszustand von ungepaarten Adenosin- und Cytosin-Nukleotiden binden und verändern kann (Tijerina et al., 2007; Rouskin et al., 2014). Das DMS-Footprinting ist für die Strukturanalyse von RNA optimiert. Die Bindung von Proteinen an RNA erzeugt einen „Fußabdruck“, der aufgrund von Veränderungen in der RNA-Struktur zurückverfolgt werden kann. Die Transkriptgröße, die ausgewertet werden kann, ist eher klein (<500 nt), aber diese Methode kann sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden, da DMS die Zellmembran leicht durchdringen kann. DMS-seq, das die DMS-Methylierung mit NGS kombiniert, wurde kürzlich in vivo durchgeführt (Ding et al., 2014; Rouskin et al., 2014).

Targeted Structure-Seq

Targeted Structure-Seq beruht auf der RNA-Methylierung durch DMS, die in vivo durchgeführt wird. Anschließend wird die RNA aus den Zellen isoliert, und die Methylierungsstellen werden mit genspezifischen Primern für die reverse Transkriptionsreaktion bestimmt. Die Sequenzierung der von der DMS abgeleiteten Fragmente kann zur Bewertung der zellulären Konformation der RNA verwendet werden. Auf der Grundlage dieser Methode wurden Strukturmodelle von Elementen innerhalb von Xist entwickelt (Fang et al., 2015). Obwohl ursprünglich unter Verwendung von DMS berichtet, kann dieser Arbeitsablauf für andere Sondierungsreagenzien angepasst werden.

SHAPE

SHAPE (selektive 2′-Hydroxy-Acylierung durch Primer-Verlängerung) kann die RNA-Struktur sowohl in vitro als auch in vivo unter Verwendung der Chemikalie NMIA und ihrer Derivate abfragen, um flexible Regionen in der RNA-Sekundärstruktur zu erkennen (Wilkinson et al., 2006; Weeks und Mauger, 2011). Es wurden mehrere SHAPE-Reagenzien getestet, um das Verhältnis von Signal zu Hintergrund zu verbessern (Lee et al., 2017). Bei SHAPE werden die 2′-Hydroxylgruppen aller vier Nukleotide selektiv acyliert, wenn sie flexibel und ungepaart sind. Dies führt zur Bildung von kovalenten SHAPE-Addukten, die die reverse Transkription blockieren und zu verkürzten cDNA-Fragmenten führen. SHAPE-Reaktivitäten können dann verwendet werden, um Sekundärstrukturen zu modellieren und jeden Prozess zu quantifizieren, der die RNA-Dynamik moduliert.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP (SHAPE und Mutationsprofilierung) war das erste Verfahren, das das SHAPE-Protokoll mit NGS kombinierte. SHAPE-MaP, das ursprünglich zur Definition des HIV-1-RNA-Genoms durchgeführt und berichtet wurde, ist eine hochempfindliche Technik, die eine schnelle De-novo-Entdeckung und direkte Validierung neuer funktioneller Motive ermöglicht (Siegfried et al., 2014; Mustoe et al, 2018).

In-cell SHAPE-Seq

In-cell SHAPE-Seq ist eine Modifikation der SHAPE-Seq-Technik, die SHAPE-Seq mit Genexpressionsmessungen kombiniert, um den Zusammenhang von RNA-Struktur und Funktion in vivo aufzuklären. Sie deckte translationale Regulationsmechanismen in E. coli in vivo auf (Watters et al., 2016).

icSHAPE-seq

icSHAPE-seq (in vivo click SHAPE sequencing) verwendet die in-cell SHAPE-Chemikalie NAI-N3, gefolgt von einer selektiven chemischen Anreicherung von NAI-N3-modifizierter RNA, die ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bietet (Flynn et al., 2016). Die anschließende NGS ermöglicht eine genaue Identifizierung mit Einzel-Nukleotid-Auflösung. In embryonalen Stammzellen der Maus wurde gezeigt, dass die RNA-Faltung in vitro ausschließlich durch die Sequenz programmiert wird, während die RNA-Struktur in vivo vom Kontext der intrazellulären Umgebung und der Interaktion mit RNA-bindenden Proteinen abhängt, was zu fokalen strukturellen Umlagerungen führen kann (Spitale et al., 2015). Daher bietet dieser Test die spannende Möglichkeit, das RNA-Strukturom in vivo in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Stimulation zu betrachten.

RNA Structurome and Interactome Determination

PARIS

PARIS (psoralen analysis of RNA interactions and structures) wurde kürzlich entwickelt, um sowohl die RNA-Struktur als auch Interaktionen in vivo zu bestimmen. Es verwendet den hochspezifischen und reversiblen Nukleinsäurevernetzer 4′-Aminomethyltrioxsalen, um Basenpaare in lebenden Zellen zu fixieren. Anschließend wird durch partiellen RNase- und vollständigen Proteinase-Verdau eine Reihe kleiner vernetzter und direkt basengepaarter RNA-Fragmente aufgereinigt. Die Aufreinigung der vernetzten Fragmente mittels 2D-Elektrophorese, gefolgt von der Proximity-Ligation von Duplex-RNA-Fragmenten, der Umkehrung der Vernetzungen und der Hochdurchsatz-Sequenzierung zeigt die direkte Basenpaarung zwischen den Fragmenten. Auf der Grundlage dieser Lesungen können Modelle von RNA-Strukturen und -Interaktionen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit erstellt werden (Lu et al., 2016). Mit diesem Ansatz wurde ein Modell für die Struktur höherer Ordnung von Xist untersucht (Lu et al., 2016). Erfreulicherweise stimmen diese Ergebnisse mit kristallographischen Studien der definierten Domänen in vitro überein (Arieti et al., 2014).

Strukturbestimmung von lncRNAs in vivo

Die Strukturbestimmung von lncRNAs in vivo ist eine große Herausforderung, da sie sehr heterogen sind und Regionen mit gut definierten Basenpaaren, andere ohne Basenpaare und Regionen mit multiplen Strukturen aufweisen. Darüber hinaus können sich lncRNAs über Tausende von Nukleotiden erstrecken, sie werden in geringer Häufigkeit exprimiert und sind in der Regel Teil von Multikomponentenkomplexen (Busan und Weeks, 2017). Dennoch wurde die Struktur mehrerer lncRNAs experimentell bestimmt (Tabelle 1).

Xist

Dies ist eine sehr lange lncRNA (17.000 Nukleotide), die die Inaktivierung des X-Chromosoms kontrolliert. Sie breitet sich über das gesamte Chromosom aus und löst stabile epigenetische Veränderungen durch Rekrutierung des PRC2-Komplexes und Anreicherung für die repressive Chromatinmodifikation H3K27me3 aus (Simon et al., 2013; Fang et al., 2015; Smola et al., 2016). In vivo SHAPE-Daten identifizierten 33 Regionen in Xist, die gut definierte Sekundärstrukturen bilden, die durch strukturell variable und dynamische Regionen verbunden sind.

RepA

Dies ist eine 1.600 Nukleotide lange Maus-lncRNA, die von einem internen Promotor auf dem Xist-Gen-Sinnstrang kodiert wird. Durch SHAPE- und DMS-Sondierung in vitro wurde eine komplizierte Struktur aus drei unabhängig voneinander gefalteten Modulen aufgedeckt. Phylogenetische Analysen und computergestützte 3D-Modellierung zeigten eine definierte tertiäre Architektur, die sich in Abwesenheit von Proteinpartnern autonom bilden kann (Liu et al., 2017a).

Rox1/Rox2

In Drosophila wird die Dosierungskompensation durch zwei lncRNAs erreicht, die vom X-Chromosom transkribiert werden. Die RNA auf X 1 und 2 (roX1 und roX2) sind 3.700 bzw. 1.200 Nukleotide lang. In-vitro-SHAPE-Sondierungen und PARS-Analysen ergaben gemeinsame, konservierte und unterschiedliche strukturelle Motive, die als Zielorte und Montageplattformen für den männlich-spezifischen letalen Komplex fungieren könnten (Ilik et al., 2013).

SRA

Der menschliche Steroidrezeptor-RNA-Aktivator (SRA) ist eine 870 Nukleotide lange lncRNA, die von einem Gen abgeleitet ist, das sowohl lncRNA- als auch proteinkodierende Transkripte kodiert. Die Struktur von SRA wurde experimentell mit Hilfe von SHAPE und DMS chemischer Sondierung in vitro untersucht. Parallel dazu wurde eine enzymatische RNase-V1-Sondierung durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass SRA aus vier verschiedenen Domänen mit einer Vielzahl von Sekundärstrukturen besteht (Novikova et al., 2012). Noch wichtiger ist, dass die vergleichende Strukturanalyse zwischen Maus und Mensch stark darauf hindeutet, dass eine große Anzahl von evolutionären Veränderungen nur minimale Mutationseffekte auf das vom Locus abgeleitete Protein hatte, während der RNA-Strukturkern stabilisiert wurde (Novikova et al, 2012).

HOTAIR

Diese lncRNA, die über die Regulierung der Ablagerung extrazellulärer Matrix und der Apoptose glatter Muskelzellen der menschlichen Aorta mit sporadischen thorakalen Aortenaneurysmen assoziiert ist, spielt eine Schlüsselrolle im kardiovaskulären System (Guo et al., 2017). Bei Patienten mit Herzinsuffizienz ohne Endstadium gehörte HOTAIR zu einer Gruppe von lncRNAs, die signifikant moduliert waren (Greco et al., 2016). Eine schützende Rolle von HOTAIR in Kardiomyozyten (Gao et al., 2017) und als zirkulierender Biomarker für akuten Myokardinfarkt und angeborene Herzerkrankungen wurden ebenfalls vorgeschlagen (Jiang et al., 2018). Hotair ist 2.148 Nukleotide lang, was die Strukturbestimmung extrem schwierig macht. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein nicht-denaturierendes Reinigungsprotokoll eingeführt, um eine homogene und monodisperse Form zu erhalten. Strukturelle Module und verschiedene evolutionär konservierte Elemente wurden in vitro durch chemische Sondierung mit SHAPE- und DMS-Reagenzien bestimmt (Somarowthu et al., 2015).

Braveheart

Braveheart ist eine 590 Nukleotide lange lncRNA, die in trans die kardiovaskuläre Abstammung reguliert. Die Sekundärstruktur von Braveheart wurde experimentell mit SHAPE- und DMS-Sondierungen in vitro untersucht. Es zeigte sich, dass Braveheart in einer hochkomplexen modularen Struktur organisiert ist, die drei Domänen umfasst, bestehend aus 12 Helices, 8 terminalen Schleifen, 5 großen internen Schleifen und einer Fünf-Wege-Kreuzung. Interessanterweise enthält es eine 5′ asymmetrische G-reiche interne Schleife (AGIL) und einen 55 Nukleotidabschnitt am 3′-Ende, der eine hohe Reaktivität aufweist, was auf eine geringe Strukturwahrscheinlichkeit schließen lässt. Die genetische Deletion dieses spezifischen 11-Nukleotid-Fragments zeigte, dass das AGIL-Motiv für die Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus zu Kardiomyozyten durch die Bindung des Zing-Finger-Proteins CNBP/ZNF9 essentiell ist (Xue et al., 2016).

Future Directions

Die Bestimmung der RNA-Struktur in Kombination mit genetischen Manipulationen kann die wichtigen Funktionsbereiche von lncRNAs aufklären. Zu diesem Zweck sollten fortschrittliche experimentelle Werkzeuge, Bioinformatik und Genom-Engineering integriert werden. Das CRISPR/Cas9-Gen-Editing-System hat sich als robuste Technologie erwiesen, mit der gezielte Veränderungen an präzisen genomischen Stellen vorgenommen werden können. Cas9, eine Nuklease, die doppelsträngige Brüche (DSBs) in der DNA verursachen kann, kann durch ein RNA-Molekül (sgRNA), das aus einer kleinen, 20 Nukleotide langen variablen Sequenz und einer adaptorischen transaktivierenden RNA besteht, in die unmittelbare Nähe des proto-adjacent motif NGG gelenkt werden. Präzise Insertionen, Deletionen oder Basenaustausche können an einer DSB-Stelle (Lin et al., 2014) in primären Zellen und in vivo in Mausmodellen von Krankheiten (Platt et al., 2014; Abrahimi et al., 2015) eingeführt werden. Eine modifizierte Version des CRISPR/Cas9-Systems wurde kürzlich für Screenings von funktionellen lncRNAs im Genommaßstab eingesetzt. Bei diesem CRISPR-Interferenzansatz wird ein nukleasefreies Cas9 (dCas9) verwendet, das nicht in der Lage ist, DSB an der DNA zu induzieren. Fusioniert mit einer Repressordomäne (z. B. KRAB) (Liu et al., 2017b) oder einer Aktivierungsdomäne (z. B. VP64) (Konermann et al., 2015; Bester et al., 2018) kann dCas9 durch sgRNAs zu spezifischen Loci in der stromaufwärts gelegenen regulatorischen Region gelenkt werden, um die Repression bzw. Aktivierung der lncRNA-Transkription auszulösen. Solche Ansätze sind äußerst nützlich, um die Funktionalität von lncRNAs im Hochdurchsatz zu testen.

Sobald spezifische lncRNAs identifiziert sind, sind Technologien, die die lncRNA-Struktur in vivo definieren können, von entscheidender Bedeutung, um lncRNA-Module und Strukturdomänen zu bestimmen. Die Bestimmung der RNA-Struktur kann mit einer vergleichenden Genomanalyse gekoppelt werden, bei der die Positionserhaltung und die Tatsache berücksichtigt werden, dass lncRNAs eher auf kurzen Elementen als auf langen Abschnitten konservierter Sequenzen beruhen können. Genetische Studien, die genau auf diese strukturellen Domänen abzielen und gleichzeitig die Expression der lncRNA aufrechterhalten (Matsumoto et al., 2017), werden die funktionellen Auswirkungen dieser Motive aufzeigen. Die Verwendung von CRISPR/Cas9-Gene Editing in induzierten pluripotenten Stammzellen, die klonal expandiert werden können, um definierte Deletionen der strukturellen Motive zu beherbergen und sich zu anderen Zelltypen zu differenzieren (Cochrane et al., 2017; Granata et al., 2017), kann schlüssige Beweise für die funktionellen Auswirkungen dieser Domänen im kardiovaskulären System liefern. Das Potenzial dieser Elemente als neuartige Angriffspunkte könnte weiter erforscht werden, um präzise Interventionen zu ermöglichen, die sich für therapeutische Anwendungen eignen.

Beiträge der Autoren

AZ initiierte die Studie, entwarf ihre Struktur und schrieb das Manuskript. AA leistete konzeptionelle Beratung und überarbeitete das Manuskript. KS entwarf die Struktur der Studie, gab konzeptionelle Ratschläge und überarbeitete das Manuskript. Alle Autoren lasen und genehmigten die eingereichte Version.

Finanzierung

Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation finanziert. AZ ist ein Intermediate Fellow der British Heart Foundation (FS/13/18/30207).

Erklärung zu Interessenkonflikten

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.