— FRAPcms

FRAP ist eine fluoreszenzmikroskopische Methode zur Untersuchung der Mobilität von fluoreszenzmarkierten Molekülen in lebenden Zellen. Sie wird für die Analyse der Moleküldiffusion innerhalb der Zelle, der Fluidität von Biomembranen und der Proteinbindung eingesetzt.

Prinzip:

FRAP kann mit einem modernen konfokalen Mikroskop durchgeführt werden. Es erfordert eine Fluoreszenzmarkierung des interessierenden Moleküls, z. B. durch einen GFP-markierten Antikörper. Ein typisches FRAP-Experiment umfasst drei verschiedene Phasen. Zunächst wird die anfängliche Fluoreszenz in der Region gemessen, die von Interesse ist. Anschließend werden die fluoreszierenden Moleküle in einem ausgewählten Bereich photobleached. Dies geschieht durch Fokussierung des Laserstrahls auf den betreffenden Bereich, was zu einer intensiven Beleuchtung und Auslöschung der Fluorophore führt. Als Ergebnis ist ein dunkler Bereich in der ansonsten fluoreszierenden Probe zu beobachten. Schließlich können fluoreszierende Moleküle aus der Umgebung durch die Probe diffundieren und die photobleachierten Moleküle gegen intakte austauschen. Diese Fluoreszenzerholung wird über die Zeit gemessen.

Da viele Faktoren die Erholungskinetik beeinflussen können, müssen die FRAP-Experimente gut geplant und die resultierenden Daten sorgfältig ausgewertet werden. Es ist dann möglich, die Parameter für den Diffusionskoeffizienten und die Molekülmobilität mit Hilfe mathematischer Modelle zu ermitteln.