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U.S. Food and Drug Administration

Manuel d’analyse bactériologique (BAM) Page principale

Auteurs : Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett et Jennifer M. Hait

Historique de révision :

  • Juin 2017 – Un nouveau chapitre 13B a été ajouté au Manuel d’analyse bactériologique
  • Janvier 2018 – Hyperlien pour le formulaire 4 du CDC APHIS/CDC corrigé

L’intoxication alimentaire staphylococcique (SFP) est une intoxication résultant de la consommation d’aliments contaminés par des niveaux adéquats d’entérotoxines préformées. Les symptômes du SFP se manifestent dans les 2 à 8 heures suivant l’ingestion et comprennent des nausées, des vomissements, des crampes abdominales avec ou sans diarrhée qui disparaissent généralement dans les 24 à 48 heures. (Argudin et al., 2010). Le nombre de personnes touchées par la PFS n’est qu’une estimation en raison des diagnostics erronés et des épidémies mineures qui ne sont pas signalées. L’hospitalisation est rare, mais a été notée chez les personnes immunodéprimées en particulier les personnes âgées et très jeunes (Scallan et al., 2011).

Les staphylocoques sont normalement présents sur la peau et les muqueuses humaines avec environ 20-30% pour une colonisation persistante et 60% pour une colonisation intermittente (Kluytmans et al., 2005). Les manipulateurs d’aliments qui sont colonisés par des staphylocoques entérotoxiques sont considérés comme la principale source de contamination des aliments par contact direct avec les produits ou les surfaces de contact. Les animaux tels que les vaches laitières peuvent également être porteurs de staphylocoques et constituer une source de contamination du lait et des produits laitiers. Enfin, les staphylocoques présents dans l’environnement peuvent être transférés aux produits alimentaires servant de source potentielle de contamination (Gutiérrez et al., 2012).

Les aliments couramment liés aux PFS comprennent les aliments transformés, la viande, la volaille, les produits laitiers et les produits de boulangerie. Une fois que l’aliment est contaminé, la croissance des staphylocoques et la production d’entérotoxines peuvent se produire, surtout si les bonnes conditions de fabrication ne sont pas suivies pour empêcher la croissance, comme les conditions de stockage réfrigérées ou les étapes de destruction par la chaleur comme la pasteurisation (Gutiérrez et al., 2012). Les entérotoxines staphylococciques sont stables à la chaleur et ne sont pas dénaturées à moins d’être exposées à des températures élevées pendant de longues périodes, c’est-à-dire, autoclave à 121°C (250°F) à 15 PSI pendant 60 minutes (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus est le plus souvent lié aux épidémies d’intoxication alimentaire staphylococcique, mais d’autres staphylocoques entérotoxigènes à coagulase positive tels que S. hyicus et S. intermedius ont également été impliqués dans des épidémies (Hennekinne et al., 2010). Les entérotoxines staphylococciques (SE) sont des exotoxines pyrogènes avec une activité superantigénique. Les entérotoxines sont des protéines globulaires qui résistent à la chaleur et aux protéases, avec une taille moléculaire moyenne d’environ 25 kDa. Les estimations de la quantité de toxine nécessaire pour provoquer une maladie sont très faibles. Une épidémie liée au lait chocolaté a détecté des niveaux de SEA à 0,5ng/ml (Evenson et al., 1988) et 0,38ng/ml de SEA a été détecté dans une épidémie liée au lait en poudre (Asao, et al., 2003).

Les SE classiques (SEA-SEE) et les SE non classiques, SEG, SEH, SEI, SER et SET ont une activité émétique prouvée. L’activité émétique des entérotoxines SE-like SElJ-SElQ, SElS, SElU et SElV n’a pas encore été démontrée. Tous les gènes se et sel ont été localisés sur des éléments génétiques mobiles, y compris des bactériophages, des îles de pathogénicité, des plasmides ou des transposons (Argudin et al., 2012).

La détection des SE est primordiale pour la sécurité alimentaire et la protection de l’approvisionnement alimentaire. Les méthodes de détection des SE reposent sur des tests immunoenzymatiques polyvalents (ELISA) ou des tests immunoenzymatiques fluorescents (EFLA) disponibles dans le commerce avec des anticorps qui détectent les SEA-SEE. Les méthodes monovalentes sont spécifiques des SEA-SEE et peuvent être utilisées pour distinguer ces types. Ces méthodes nécessitent l’extraction de l’entérotoxine de l’aliment suspect avant l’analyse. La sensibilité et la sélectivité de la méthode sont améliorées par la concentration par dialyse de l’extrait alimentaire, mais les contraintes de temps peuvent nécessiter un test préliminaire sans concentration. Cependant, la concentration par dialyse doit être effectuée sur tous les produits laitiers avant l’analyse (Hennekinne et al., 2012).

CAUTION : Les entérotoxines staphylococciques sont hautement toxiques et les procédures susceptibles de créer des aérosols doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique (BSC) approuvée. Les entérotoxines staphylococciques (SEA, SEB, SEC, SED et SEE) sont des agents sélectifs. Les scientifiques doivent suivre les directives établies par le CDC : https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Équipement et matériel spéciaux
    1. Salle à température contrôlée ou réfrigérateur 2-8°C.
    2. Blender ou homogénéisateur.
    3. Incubateur 35-37°C.
    4. Balance analytique et bateaux de pesée.
    5. Tableau pour dialyse.
    6. pH mètre. Le pH pendant l’extraction et le pH des tampons utilisés dans l’extraction sont importants. Effectuez des ajustements à ± 0,1 unité de pH.
    7. Centrifugeuse réfrigérée 2-8°C.
    8. La vaisselle de laboratoire en verre ou en polypropylène pour éviter l’adsorption des toxines.
    9. Un tissu filtrant est utilisé pour recueillir les débris après la centrifugation. Souvent, plusieurs couches d’étamine grossière pré-mouillée sont utilisées pour effectuer cette tâche.
    10. Entonnoir sceptique.
    11. Membrane de dialyse MWCO 6 000-8 000 Daltons (par exemple Spectra/Por® avec fermetures) largeur plate 23 ± 2 mm.
    12. Dispositifs de filtration en tube conique sous vide (membrane de 0,22µm) tels que Steriflip (EMD Millipore) recommandés pour filtrer les surnageants de culture liquide comme mesure de sécurité pour éviter l’aérosolisation des entérotoxines.
    13. Cabinet de sécurité biologique.
  2. Réactifs

    Note : les fabricants de kits peuvent exiger différents tampons ou solvants.

    1. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4 : 145 mM/10 mM) pour préparer 1L de PBS, dissoudre 9 g de NaCl et 3,58 g de Na2HPO4 dans 1L d’eau distillée. Ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 en utilisant HCl.
    2. Chlorure de sodium (NaCl).
    3. Phosphate de sodium (Na2HPO4).
    4. Polyéthylène glycol (PEG) (20 000 mol en poids) Préparer une solution de PEG à 30 % (p/v) en ajoutant 30 g de PEG pour chaque 70 ml d’eau distillée.
    5. 1 N (ou 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (ou 0,1 N) HCl.
  3. Préparation de la membrane de dialyse
    Couper la membrane de dialyse suffisamment longue pour accueillir l’extrait alimentaire à concentrer. Tremper la tubulure dans 2 changements d’eau distillée pour enlever le revêtement de glycérol. Utiliser une fermeture de membrane ou attacher une extrémité de la tubulure avec 2 nœuds rapprochés. Remplissez le tube d’eau distillée et vérifiez qu’il n’y a pas de fuites en pressant le sac rempli tout en maintenant l’extrémité ouverte bien fermée. Vider le sac et le placer dans de l’eau distillée jusqu’à son utilisation.
  4. Extraction d’entérotoxine d’une portion d’aliment

    NOTE : cette procédure et d’autres procédures qui peuvent générer des aérosols de micro-organismes pathogènes ou d’entérotoxines doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité approuvée.

    1. Si possible, broyer le produit alimentaire entier ou des portions de sélections représentatives du produit dans un mélangeur pour homogénéiser l’échantillon afin que tout SE présent dans l’aliment soit distribué uniformément.
      1. Pour les fromages à croûte, prélever un échantillon de fromage avec 10 % de croûte et 90 % de fromage.
      2. Pour les produits séchés, utiliser des quantités égales d’eau avec le produit pour le mélanger ou suivre les instructions du fabricant.
    2. Peser 25 g d’échantillon dans un bécher en verre et transférer la portion à tester dans un mélangeur avec 40 ml d’eau distillée et mélanger à grande vitesse pendant 3 minutes en générant une bouillie homogénéisée. Ne pas ajouter d’eau aux échantillons liquides, mais passer à l’étape 3.
    3. Laisser la toxine se diffuser en agitant l’échantillon à température ambiante pendant 30 minutes.
    4. Acidifier le mélange avec du HCl 0,1N pour obtenir un pH compris entre 3,5 et 4,0. Remarque : si le pH descend en dessous de 3,0, une autre portion de 25 g doit être préparée.
    5. Transférer la suspension acidifiée dans des tubes coniques de 50 ml en propylène. Centrifuger à 3 130 × g pendant 20 min à 5°C. Des vitesses inférieures avec un temps de centrifugation plus long peuvent être utilisées, mais le dégagement de certains aliments n’est pas aussi efficace. La séparation des matières grasses est inefficace à moins que les aliments ne soient centrifugés à température réfrigérée.
    6. Décanter le liquide surnageant dans un bécher de 800 ml à travers une étamine ou un autre matériau filtrant approprié placé dans une ampoule à décanter. Si le surnageant n’est pas clair, centrifuger à nouveau et décanter le fluide à travers l’étamine. Testez le pH qui doit être compris entre 3,5 et 4,5. Si le pH est correct, neutralisez le mélange avec du NaOH 0,1N pour obtenir un pH entre 7,4 et 7,6.
    7. Si le pH est >4,5 répétez l’acidification, mais si <3,0 ou= » »>9,0 répétez le processus avec une autre portion alimentaire de 25 g.
    8. Pourvu qu’il y ait suffisamment d’échantillon disponible pour répéter le test, une aliquote peut être prélevée pour le dépistage à l’aide d’un test validé (voir Sec. H). Si les résultats du dépistage sont négatifs, l’extrait restant doit être concentré par dialyse et testé à nouveau.
  5. Concentration de l’extrait par dialyse
    1. Placer l’extrait dans le sac de dialyse préparé. Poser le sac fermé sur un plateau et immerger le sac dans du PEG à 30% (p/v). Maintenir à 5°C jusqu’à ce que le volume soit réduit à 15-20 ml ou moins. Ce processus peut prendre de 24 à 72 heures, mais si le volume n’est pas réduit après une nuit de conservation, ajouter du PEG en poudre au plateau. Retirer le sac du PEG et laver soigneusement l’extérieur avec de l’eau pour enlever tout PEG adhérant au sac. Faire tremper dans de l’eau distillée pendant 1 à 2 minutes. Verser le contenu dans un petit bécher.
    2. Rincer l’intérieur du sac avec 2 à 3 ml d’eau distillée (le PBS est utilisé pour le lait et les produits laitiers) en faisant courir les doigts de haut en bas à l’extérieur du sac pour enlever le matériel adhérant aux côtés de la tubulure. Répétez le rinçage jusqu’à ce que l’eau de rinçage soit claire. Garder le volume aussi petit que possible.
    3. Ajuster le pH de l’extrait à 7,4-7,6.
    4. Les extraits concentrés doivent être analysés dans les 48 heures et conservés à 3-5°C, sinon, congeler les extraits à 18-20°C et les décongeler complètement à 3-5°C avant de les tester. Certains tests tels que le Vidas SET2 nécessitent une analyse immédiate.
  6. Tester les SE à partir de cultures bactériennes

    Les souches staphylococciques suspectées de produire des entérotoxines peuvent être pré-enrichies dans un bouillon nutritif tel que TSB ou BHI.

    1. Transférer deux ou trois colonies morphologiquement similaires dans 10 ml de bouillon nutritif.
    2. Incuber à 35-37°C pendant la nuit sur un agitateur orbital.
    3. Centrifuger les cultures 5 minutes 3500 × g à 10°C
    4. Filtrer le surnageant en utilisant un dispositif de filtration sous vide Steri-Flip avec un filtre de 0,22µm ou un autre système fermé pour éviter l’aérosolisation des entérotoxines. Cette procédure doit être effectuée dans une armoire de sécurité biologique pour assurer la sécurité du scientifique.
    5. Les surnageants de culture peuvent avoir des niveaux élevés de SE qui sont en dehors de la gamme linéaire de la trousse peuvent nécessiter une dilution avec du PBS.
  7. Rapport des résultats

    La présence d’entérotoxine staphylococcique détectée dans les produits alimentaires doit être signalée au programme fédéral d’agents sélectifs géré par le Center for Disease Control and Protection (CDC) : https://www.selectagents.gov/form4.html en remplissant le formulaire APHIS/CDC 4.

    Les résultats positifs sont signalés comme entérotoxine staphylococcique détectée dans × g (ml) de produit. Les résultats négatifs doivent être rapportés comme entérotoxine staphylococcique non détectée dans × g (ml) de produit.

  8. Notes

    La trousse doit être capable de détecter l’entérotoxine au niveau minimum de 0,05ng/g avec des niveaux élevés de sensibilité relative (>90%) et de spécificité relative (>90%).

    La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans la méthode est uniquement destinée à des fins d’information scientifique et n’implique pas une recommandation ou une approbation par la Food and Drug Administration des États-Unis. Deux méthodes sont couramment utilisées pour la détection des SE, notamment la méthode Vidas SET2 (bioMérieux, Inc.), approuvée par l’AOAC, qui est un test automatisé polyvalent par fluorescence lié à une enzyme (EFLA) qui détecte les SEA-SEE (Méthode officielle 2007.06 de l’AOAC VIDAS SET2 pour la détection de l’entérotoxine staphylococcique dans certains aliments, Action finale, 2010). Le numéro de catalogue actuel de Vidas Set2 est Ref. 30705. Le Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) est un dosage immunoenzymatique manuel réalisé dans des puits recouverts d’anticorps polyvalents. Le kit polyvalent Ridascreen détecte les entérotoxines staphylococciques SEA-SEE et a été validé et vérifié par des essais circulaires et des études de validation par des tiers menées par le Laboratoire de référence de l’Union européenne pour les staphylocoques à coagulase positive pour le mandat du Comité européen de normalisation (CEN) proposé par la norme ISO 19020. Un kit monovalent Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG) est disponible, mais ce kit n’a pas été validé par une tierce partie. Le numéro de catalogue du kit polyvalent Set Total est R4105 (96 tests) ou R4106 (48 tests) . Le numéro de catalogue du kit SET A,B,C,D,E monovalent est R4101.

Interférences

Des réactions non spécifiques peuvent se produire dans les produits alimentaires qui ont des enzymes endogènes telles que la lactoperoxydase ou la phosphatase alcaline et interfèrent avec des kits tels que Vidas SET2 qui utilise la phosphatase alcaline comme enzyme de détection (Vernozy-Rozand, et al, 2005). Il est recommandé de confirmer tous les résultats positifs par une méthode alternative utilisant une enzyme de détection différente. Dans le cas du Vidas SET2, une méthode alternative est le Ridascreen SET Total qui utilise la lactoperoxydase.

Un traitement thermique peut être appliqué pour éliminer la phosphatase alcaline endogène de l’échantillon comme suit :

  • Transférer 600 μL d’extrait concentré dans un tube
  • Chauffer à 80°C pendant 2 minutes
  • Répéter le test Vidas SET2 avec le concentré refroidi. Une certaine perte d’entérotoxine peut se produire.

Si un résultat inexact est suspecté en utilisant le Ridascreen ou un autre kit utilisant la lactoperoxydase, transférer 100 μL d’extrait concentré dans un tube. Ajoutez 50μL chacun de solutions de substrat et de kit chromagène. Mélangez et observez l’apparition d’une couleur bleu-vert. Si une couleur bleu-vert apparaît, cela indique que la lactoperoxydase intrinsèque est présente dans l’échantillon et a interféré avec le test. Une méthode de détection différente doit donc être utilisée.

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