Signification clinique de l’expression des récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2 dans les lésions thyroïdiennes humaines malignes et bénignes

Abstract

Le système endocannabinoïde est composé de récepteurs cannabinoïdes (CB1 et CB2), leurs ligands endogènes (endocannabinoïdes), et des protéines responsables de leur métabolisme participent à de nombreuses fonctions différentes indispensables à la régulation homéostatique dans plusieurs tissus, exerçant également des effets antitumoraux. La présente étude visait à évaluer la signification clinique de l’expression des protéines CB1 et CB2 dans les lésions thyroïdiennes humaines bénignes et malignes. L’expression des protéines CB1 et CB2 a été évaluée par immunohistochimie sur des tissus thyroïdiens inclus en paraffine provenant de 87 patients présentant des lésions bénignes et malignes et a été analysée statistiquement avec les paramètres clinicopathologiques, la capacité de prolifération des cellules folliculaires et le taux de risque de récidive estimé selon le système de stadification de l’American Thyroid Association (ATA). L’expression accrue de CB1 et CB2 était significativement plus fréquente dans les lésions thyroïdiennes malignes que dans les lésions bénignes ( et , respectivement). L’expression accrue de CB1 et CB2 était également significativement plus fréquente dans les carcinomes papillaires que dans les nodules hyperplasiques ( et , respectivement). Dans les lésions thyroïdiennes malignes, l’expression élevée du gène CB2 était significativement associée à la présence de métastases dans les ganglions lymphatiques. Une expression accrue de CB2 a également été observée plus fréquemment dans les cas de thyroïde maligne avec présence d’invasion capsulaire, lymphatique et vasculaire, ainsi que dans ceux présentant un risque accru de récidive, à un niveau non significatif cependant, alors que l’expression de CB1 n’était associée à aucun des paramètres clinicopathologiques examinés. Nos données suggèrent que les récepteurs CB peuvent être impliqués dans la transformation maligne de la thyroïde et surtout le récepteur CB2 pourrait servir de biomarqueur utile et de cible thérapeutique potentielle dans la néoplasie thyroïdienne.

1. Introduction

Le système endocannabinoïde (ECS) est un système endogène d’induction de signaux lipidiques, présent dans divers tissus humains, qui exerce de nombreuses fonctions différentes et non liées. Des études substantielles ont indiqué les effets régulateurs du SCE sur le système nerveux central et périphérique, le tractus gastro-intestinal et le système immunitaire, étant impliqués dans de multiples processus, tels que la motilité gastro-intestinale, l’humeur, la régulation de la douleur, la mémoire et l’appétit. Ces fonctions sont déclenchées par la liaison de ligands endogènes et exogènes aux récepteurs cannabinoïdes (récepteurs CB). Outre ces fonctions bien connues, le SCE exerce également des effets antiprolifératifs par la modulation de plusieurs voies de signalisation , tandis que son activation peut avoir une signification pronostique pour la progression du développement tumoral .

Deux sous-types de récepteurs CB existent, avec une distribution différente parmi les tissus humains. Le récepteur CB1 est principalement situé au niveau du système nerveux central, des adipocytes, du foie, du pancréas, des muscles squelettiques et des lymphocytes T . Le récepteur CB2 est principalement détecté dans les cellules immunitaires, mais aussi dans les neurones et d’autres cellules qui composent le système nerveux central, comme les astrocytes et la microglie, ainsi que dans les cellules endothéliales cérébromicrovasculaires . L’activation des récepteurs CB inhibe la formation d’AMPc par son couplage aux protéines Gi, ce qui entraîne une diminution de la phosphorylation dépendante de la protéine kinase A (PKA). Les récepteurs CB se couplent également à la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) et plus particulièrement à p42/p44 et p38, participant ainsi à la signalisation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et du céramide. D’autres récepteurs sont également attachés à l’ECS comme les canaux cationiques à potentiel transitoire de la sous-famille V membre 1 (TRPV-1), les récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) et les récepteurs couplés aux protéines G non CB1/CB2 GPR55 .

Les ligands de l’ECS sont les cannabinoïdes, y compris les composants bioactifs du Cannabis Sativa, les composés synthétiques CB-mimétiques et les ligands endogènes des récepteurs CB . La molécule la plus importante de la première catégorie est le Δ9-THC, qui est bien connu pour ses caractéristiques psychoactives. Les deux autres catégories comprennent les ligands synthétiques actuellement en cours de développement (CP55940, HU-210, HU-211, ab-cannabidiol, acide ajulémique, WIN55,212-2) et les endocannabinoïdes qui sont produits par le corps humain et sont des dérivés lipidiques messagers de l’acide arachidonique (AA) conjugués à l’éthanolamine ou au glycérol . Les plus importantes de ces molécules sont l’anandamide (AEA) et le 2-arachidonoylglycérol (2-AG), mais d’autres substances ont également été identifiées, comme la O-arachidonoyléthanolamine (OAE, virodhamine), l’éther de 2-arachidonoylglycérol (2-AGE, éther de noladine), la N-arachidonoyldopamine (NADA) et le palmitoyléthanolamide (PEA). Outre les récepteurs CB et tous leurs ligands, le SCE comprend également les enzymes essentielles à la biosynthèse, au transport et à la dégradation des ligands.

En plus des fonctions du SCE visant à maintenir l’homéostasie, le dialogue croisé mentionné ci-dessus entre le SCE et les voies oncogènes les plus importantes (MAPK/ERK et voie PI3K/Akt) a récemment suscité l’intérêt et a mis en évidence l’importance du SCE dans la tumorigenèse . De plus, il a été démontré que les cannabinoïdes induisent l’apoptose des cellules cancéreuses, inhibent la vascularisation des tumeurs par la diminution du VEGF et suppriment la capacité invasive des cellules cancéreuses. Les effets antiprolifératifs prévalent et plusieurs études suggèrent que les cannabinoïdes ont un potentiel comme agents antitumoraux .

Le diagnostic des lésions thyroïdiennes a récemment augmenté, non seulement en raison de l’amélioration des techniques de diagnostic, mais aussi en raison de leur véritable augmentation d’incidence dans la population . En fait, le carcinome thyroïdien est la tumeur maligne la plus fréquente du système endocrinien . Bien que le cancer de la thyroïde soit généralement complètement guéri par la chirurgie et la thérapie, 10 à 20 % des patients meurent encore des suites d’une récidive ou de la progression de la tumeur. Par conséquent, il est essentiel d’établir de nouvelles stratégies de traitement et de trouver de nouveaux marqueurs pronostiques afin de prédire l’évolution clinique de chaque patient et d’adapter en conséquence les modalités thérapeutiques disponibles. Dans cet aspect, la présente étude visait à évaluer l’expression immunohistochimique des récepteurs CB1 et CB2 dans les lésions thyroïdiennes bénignes et malignes en association avec les caractéristiques clinicopathologiques liées au pronostic.

2. Patients et méthodes

2.1. Patients

Le matériel examiné était composé de 87 spécimens chirurgicaux thyroïdiens examinés histologiquement provenant d’un nombre égal de patients ayant subi une chirurgie thyroïdienne pour des lésions bénignes et malignes. Quarante-trois cas bénins (37 nodules hyperplasiques et 6 thyroïdites de Hashimoto) et quarante-quatre cas malins (40 carcinomes papillaires et 4 folliculaires) ont été inclus dans l’étude. Chaque néoplasme a été classé selon la classification histologique des tumeurs thyroïdiennes de l’OMS. Le risque de récidive a été estimé selon le système de classification de l’American Thyroid Association (ATA). Aucun des patients n’avait reçu un quelconque traitement anticancéreux avant la chirurgie et il n’y avait pas d’antécédents cliniques d’irradiation de la tête et du cou ou d’autres cancers.

2.2. Immunohistochimie

Des immunomarquages pour CB1 et CB2 ont été réalisés sur des coupes de tissu thyroïdien fixées au formol et incluses en paraffine à l’aide d’un anticorps IgG CB1 polyclonal de chèvre (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) et d’un anticorps IgG CB2 polyclonal de lapin (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). Brièvement, des sections de tissus de 4 μm d’épaisseur ont été déparaffinées dans du xylène et ont été portées à l’eau par des alcools gradués. La récupération de l’antigène a été effectuée en passant les lames au micro-ondes dans un tampon citrate 10 mM (pH 6,1) pendant 15 minutes (min) à haute puissance, conformément aux instructions du fabricant. Pour éliminer l’activité peroxydasique endogène, les sections ont ensuite été traitées avec du peroxyde d’hydrogène fraîchement préparé à 0,3 % dans du méthanol, dans l’obscurité, pendant 30 minutes, à température ambiante. La liaison non spécifique des anticorps a été bloquée en utilisant Eraser et Sniper, des réactifs de blocage spécifiques pour les anticorps primaires de chèvre et de lapin, respectivement (Biocare Medical, Concord, Californie, USA), pendant 5 min. Les sections ont été incubées pendant 1 heure (h), à température ambiante, avec les anticorps primaires contre CB1 et CB2 dilués respectivement à 1 : 300 et 1 : 200 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) selon les instructions du fabricant. Les sections ont ensuite été incubées à température ambiante avec un réactif de liaison biotinylé (Biocare Medical) pendant 10 minutes, puis avec un marqueur streptavidine conjugué à la peroxydase (Biocare Medical) pendant 10 minutes. L’activité immuno-peroxydase résultante a été développée à l’aide d’un kit de substrat DAB (Vector Laboratories, Californie, USA) pendant 10 min. Les sections ont été contre-colorées avec l’hématoxyline de Harris et montées dans Entellan (Merck, Darmstadt, Allemagne). Des contrôles négatifs appropriés ont été réalisés en omettant l’anticorps primaire et/ou en le remplaçant par un antisérum non pertinent. Comme contrôle positif, des sections de tissu de carcinome épidermoïde du sein et de la langue mobile dont l’expression de CB1 et CB2 est connue ont été utilisées. La capacité proliférative des cellules folliculaires a été évaluée par l’expression immunohistochimique de Ki-67, comme décrit précédemment .

2.3. Évaluation de l’immunohistochimie

L’évaluation immunohistochimique a été réalisée en comptant au moins 1000 cellules tumorales dans chaque cas par deux observateurs indépendants (Stamatios Theocharis et Paraskevi Alexandrou) aveugles aux données cliniques, avec un accord complet des observateurs. Les spécimens ont été considérés comme « positifs » pour CB1 et CB2 lorsque plus de 5 % des cellules tumorales de la section étaient colorées positivement. L’immunoréactivité des cellules tumorales pour CB1 et CB2 a été évaluée en fonction du pourcentage de cellules tumorales positives pour CB1 et CB2 : 0 : coloration négative – 0-4 % des cellules tumorales positives ; 1 : 5-24 % des cellules tumorales positives ; 2 : 25-49 % des cellules tumorales positives ; 3 : 50-100 % des cellules tumorales positives ; et son intensité : 0 : coloration négative ; 1 : coloration légère ; 2 : coloration intermédiaire ; 3 : coloration intense. Enfin, l’expression de CB1 et CB2 a été classée comme faible, si le score total était de 0 ou 2 et élevée et si le score total était ≥3 . L’immunoréactivité Ki-67 a été classée en fonction du pourcentage de cellules folliculaires positivement colorées dépassant la valeur médiane du pourcentage en deux catégories (en dessous et au-dessus de la valeur moyenne), comme indiqué précédemment .

2.4. Analyse statistique

Des tests de chi carré ont été utilisés pour évaluer la différence d’expression de CB1 et CB2 entre les lésions thyroïdiennes malignes et bénignes, ainsi qu’entre les cas de carcinome papillaire et les nodules hyperplasiques. Des tests du chi carré ont été appliqués pour évaluer les associations entre l’expression de CB1 et CB2 et les caractéristiques clinicopathologiques dans le sous-groupe de patients présentant des lésions thyroïdiennes malignes. Un résultat bilatéral a été considéré comme statistiquement significatif. Les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide du progiciel SPSS pour Windows (version 13.0 ; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

3. Résultats

3.1. Signification clinique de l’expression de CB1 dans les lésions thyroïdiennes humaines malignes et bénignes

La positivité de CB1 (score IHC > 0) a été notée dans 52 (60%) des 87 lésions thyroïdiennes. Trente et un (36 %) des 87 cas examinés présentaient une immunoréactivité CB1 élevée (score IHC ≥ 3). Le schéma subcellulaire de distribution de CB1 était principalement cytoplasmique et occasionnellement membraneux. Les zones normales avoisinant la tumeur se sont révélées négatives pour CB1. Des immunomarquages représentatifs de CB1 pour un nodule hyperplasique et un carcinome papillaire sont représentés sur les figures 1(a) et 1(b), respectivement. L’immunoréactivité de CB1 était significativement différente entre les lésions thyroïdiennes bénignes et malignes (Tableau 1, ). L’expression élevée de CB1 était significativement plus fréquente dans le carcinome papillaire que dans les nodules hyperplasiques (tableau 1, ). L’expression de CB1 n’était pas associée à l’âge et au sexe des patients ni à la capacité proliférative des cellules folliculaires. Dans le sous-groupe des lésions thyroïdiennes malignes, une forte expression de CB1 a été notée dans 23 (52 %) des 44 cas. Il n’y avait aucune association entre l’expression des récepteurs CB1 et la taille de la tumeur, la présence d’une invasion capsulaire, vasculaire ou lymphatique, les métastases ganglionnaires et le taux de prolifération des cellules folliculaires (tableau 2). L’expression des récepteurs CB1 n’était pas associée au risque de récidive estimé selon le système de stadification ATA (données non présentées).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

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(b)
(c)
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Figure 1

Immunomarquages CB1 représentatifs dans : (a) nodule hyperplasique et (b) carcinome papillaire. Immunomarquages CB2 représentatifs dans (c) nodule hyperplasique et (d) carcinome papillaire (grossissement original ×200).

3.2. Signification clinique de l’expression de CB2 dans les lésions thyroïdiennes humaines malignes et bénignes

La positivité de CB2 (score IHC > 0) a été notée dans 61 (71%) des 87 lésions thyroïdiennes. Trente-deux (37%) des 87 cas examinés présentaient une forte immunoréactivité CB2 (score IHC ≥ 3). Le schéma de distribution subcellulaire était principalement cytoplasmique et occasionnellement membraneux. Les zones normales avoisinant la tumeur se sont révélées négatives pour CB2. Les immunomarquages CB2 représentatifs des nodules hyperplasiques et du carcinome papillaire sont représentés sur les figures 1(c) et 1(d), respectivement. Une forte expression de CB2 a été observée significativement plus fréquemment dans les lésions thyroïdiennes malignes que dans les lésions bénignes, ainsi que dans le carcinome papillaire par rapport aux nodules hyperplasiques (tableau 1 et , respectivement). Dans le sous-groupe des lésions thyroïdiennes malignes, une forte expression de CB2 a été observée dans 24 (55 %) des 44 cas. L’expression élevée de CB2 était significativement associée à la présence de métastases ganglionnaires (tableau 2, ). L’expression élevée de CB2 était également associée à la présence d’une invasion capsulaire, lymphatique et vasculaire, à un niveau non significatif cependant (tableau 2, , , et , respectivement). Aucune association entre l’expression de CB2 et l’âge et le sexe des patients, la taille de la tumeur et le taux de prolifération des cellules folliculaires n’a été notée (tableau 2). Une expression élevée des récepteurs CB2 était plus fréquemment observée dans les lésions thyroïdiennes malignes présentant un risque accru de taux de récidive selon le système de stadification ATA, à un niveau non significatif cependant ().

4. Discussion

Dans la présente étude, l’expression des protéines CB1 et CB2 était accrue dans les lésions thyroïdiennes malignes par rapport aux lésions bénignes. Nous décrivons également pour la première fois une association entre l’expression de la protéine CB2 et des paramètres clinicopathologiques cruciaux pour la gestion et le pronostic des patients. Notamment, l’expression accrue de CB2 était significativement associée à la présence de métastases ganglionnaires et à la limite à la présence d’une invasion vasculaire, tandis que des associations indicatives mais non significatives avec la présence d’une invasion capsulaire et lymphatique et le taux de récidive estimé ont également été notées. Des résultats similaires pour la surexpression des récepteurs CB1 ont été obtenus, en ce qui concerne les lésions thyroïdiennes malignes par rapport aux bénignes ; néanmoins, une association non significative ou une tendance de corrélation entre l’expression de CB1 et les paramètres clinicopathologiques a été notée.

Conformément aux présents résultats, les récepteurs CB étaient régulés à la hausse dans certaines tumeurs malignes humaines, y compris le carcinome épidermoïde oral, le carcinome pancréatique, hépatocellulaire et prostatique, alors qu’ils n’étaient pas exprimés dans les tissus normaux de ces organes . D’autre part, le récepteur CB1 était régulé à la baisse dans le carcinome colorectal, contrairement aux tissus normaux adjacents, ce qui met en évidence les différents rôles du SCE dans diverses tumeurs et indique les multiples interactions entre le SCE et les mécanismes qui contrôlent la croissance et la prolifération des cellules. Ces mécanismes peuvent inclure l’induction directe de la mort des cellules transformées, l’arrêt du cycle cellulaire et l’inhibition de l’angiogenèse et des métastases tumorales. Les effets antitumoraux des SCE ont également été décrits dans de nombreuses études. Dans le cancer colorectal, les endocannabinoïdes et les cannabinoïdes synthétiques ont été capables d’induire l’apoptose et d’inhiber la carcinogenèse par des mécanismes impliquant les récepteurs CB, les canaux TRPV1 et la voie PPARγ . Des résultats similaires ont été obtenus dans des études menées sur le cancer du pancréas, du poumon, du sein, le cholangiocarcinome et le carcinome hépatocellulaire. Des effets synergiques des cannabinoïdes avec la chimiothérapie antitumorale conventionnelle ont également été signalés .

Une surexpression des récepteurs CB dans le carcinome thyroïdien a été récemment signalée, in vitro . Plus précisément, la stimulation par l’IL-12 de lignées cellulaires de carcinome thyroïdien anaplasique a induit une surexpression des récepteurs CB2 et a conduit à une apoptose et une régression tumorale médiées par les agonistes CB2. En outre, la régulation positive de CB2 a rendu les cellules tumorales plus sensibles au traitement par chimiothérapie standard. L’une des explications possibles de ce phénomène est l’activation dépendante de la céramide de la voie intrinsèque mitochondriale, qui conduit à l’apoptose, déclenchée par l’activation des récepteurs CB2. Une autre étude sur des lignées cellulaires de carcinome thyroïdien a montré que le 2-méthyl-2′-F-anandamide (Met-F-AEA) inhibait la croissance tumorale, associée à des niveaux élevés de récepteurs CB1 . L’expression abondante des récepteurs CB1 a été notée dans les lignées cellulaires plus sensibles au traitement, qui ont ensuite été plus sensibles à l’inhibition de la croissance. Ces résultats ont été attribués à l’activation et à l’augmentation de p53, ainsi qu’à la diminution de la cycline A, conduisant à l’apoptose.

En dehors des implications thérapeutiques possibles concernant la tumorigenèse et le SCE, la détection de la surexpression des récepteurs CB peut avoir un potentiel en tant qu’indicateurs de pronostic. La surexpression des deux récepteurs CB dans les échantillons de tissu de carcinome hépatocellulaire était significativement associée à un meilleur pronostic et à une survie sans maladie plus longue. Ces résultats ont été associés aux caractéristiques histopathologiques de la tumeur, car des niveaux élevés de récepteurs CB ont été observés dans les cas présentant une bonne différenciation et une atteinte limitée du tractus portal . D’autre part, l’immunoréactivité CB2 était associée à une survie sans maladie plus courte dans le carcinome épidermoïde de la tête et du cou. En ce qui concerne le récepteur CB1, sa surexpression était associée à un mauvais résultat chez les patients atteints de carcinome colorectal, prostatique et pancréatique. En particulier, l’expression accrue de CB1 chez les patients atteints de carcinome colorectal de stade IV était indépendamment corrélée à un mauvais pronostic. L’expression accrue de CB1 était également associée à un adénocarcinome prostatique agressif présentant un score de Gleason plus élevé, une tumeur de plus grande taille, un taux de prolifération cellulaire plus élevé et des métastases au moment du diagnostic. En outre, une faible expression de CB1 ou des niveaux élevés de FAAH/MAGL étaient corrélés à un taux de survie plus long et à un état douloureux plus élevé. Des résultats similaires mais non statistiquement significatifs ont été notés pour le récepteur CB2. Compte tenu des données mentionnées ci-dessus, les études actuellement disponibles sur les niveaux de récepteurs CB et leurs associations avec le pronostic de diverses tumeurs semblent contradictoires et peuvent être étroitement liées à l’étendue de la participation du SCE dans la tumorigenèse.

5. Conclusion

Des niveaux d’expression immunohistochimique des récepteurs CB1 et CB2 accrus étaient corrélés avec la malignité de la glande thyroïde. De plus, des niveaux d’expression CB2 accrus étaient associés à des caractéristiques clinicopathologiques importantes pour la prise en charge thérapeutique des patients. Ces résultats confirment que les récepteurs CB, et en particulier le récepteur CB2, peuvent interférer avec les voies moléculaires participant à la transformation maligne de la thyroïde et pourraient être considérés comme des cibles thérapeutiques potentielles pour supprimer la progression tumorale. Des études de cohorte plus importantes sont fortement recommandées afin de confirmer et d’établir l’utilité clinique des récepteurs CB en tant que marqueurs pronostiques potentiels dans la néoplasie thyroïdienne.

Conflit d’intérêts

Tous les auteurs vérifient qu’ils n’ont accepté aucun financement ou soutien d’une organisation qui pourrait, de quelque manière que ce soit, gagner ou perdre financièrement des résultats de la présente étude. Tous les auteurs vérifient qu’ils n’ont pas été employés par une organisation qui pourrait d’une manière ou d’une autre gagner ou perdre financièrement des résultats de la présente étude. Aucun des auteurs n’a d’autre conflit d’intérêts.

Contribution des auteurs

Eleftheria Lakiotaki et Constantinos Giaginis ont contribué de manière égale à l’étude.