Principe du test ELISpot

Les tests ELISpot utilisent la technique du test immuno-enzymatique (ELISA) en sandwich. Un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique de l’analyte choisi est pré-revêtu sur une microplaque à dos PVDF (difluorure de polyvinylidène). Des cellules stimulées de manière appropriée sont pipetées dans les puits et la microplaque est placée dans un incubateur CO2 humidifié à 37 °C pendant une période déterminée. Pendant cette période d’incubation, l’anticorps immobilisé, à proximité immédiate des cellules sécrétrices, fixe l’analyte sécrété. Après avoir éliminé par lavage les cellules et les substances non liées, un anticorps polyclonal biotinylé spécifique de l’analyte choisi est ajouté dans les puits. Après un lavage destiné à éliminer tout anticorps biotinylé non lié, une phosphatase alcaline conjuguée à la streptavidine est ajoutée. L’enzyme non liée est ensuite éliminée par lavage et une solution de substrat (BCIP/NBT) est ajoutée. Un précipité de couleur bleu-noir se forme et apparaît sous forme de taches sur les sites de localisation des cytokines, chaque tache individuelle représentant une cellule sécrétant l’analyte. Les taches peuvent être comptées avec un système de lecture ELISpot automatisé ou manuellement, à l’aide d’un stéréomicroscope.

.