Origin of the electrophoretic force on DNA in solid-state nanopores

Le transport sous tension de macromolécules à travers des nanopores biologiques6,7 et artificiels8,9,10,11,12 constitue un système idéal pour étudier la physique du processus de translocation13. La migration électrophorétique est la principale force motrice de la translocation de l’ADN à travers les nanopores et est une conséquence de la force exercée par un champ électrique appliqué extérieurement sur les charges de la chaîne polyélectrolyte. L’ADN en solution étant chargé négativement, il est protégé par une couche de contre-ions chargés positivement, plus ou moins mobiles, qui subissent également le champ électrique. Il est reconnu depuis longtemps que la force exercée sur les contre-ions induit une force de traînée hydrodynamique sur l’ADN qui équilibre localement la force électrique, conduisant à une migration beaucoup plus lente que ce que l’on pourrait attendre de la seule traînée de Stokes (voir, par exemple, réf. 1). La translocation électrophorétique d’un polymère à travers un petit pore obéit à des principes similaires, mais ici, on s’attend à ce que la géométrie du pore (ou la structure locale du gel) influence profondément le profil d’écoulement hydrodynamique autour de l’ADN et donc la force de traînée qui s’oppose au mouvement1,5,14. Malgré des expériences de plus en plus sophistiquées3,12,15,16, une manifestation non ambiguë des interactions hydrodynamiques dans la translocation de l’ADN n’a pas encore été rapportée. Nous abordons ici cette question en utilisant notre appareil récemment mis au point, qui combine des nanopores à l’état solide et des pinces optiques3 pour arrêter la translocation de l’ADN et mesurer ensuite la force de décrochage sur un seul brin d’ADN (voir la section Méthodes). Un schéma de l’appareil de mesure est présenté dans la figure 1a.

a, Schéma de l’appareil de mesure. À l’aide de pinces optiques, la translocation de l’ADN est bloquée et la force sur l’ADN est mesurée. La conductance ionique du nanopore est également mesurée simultanément. b, Modèle cylindrique d’ADN dans un nanopore. Les flèches bleues de chaque côté de l’ADN représentent schématiquement la vitesse du fluide en mouvement due à l’électro-osmose.

Contrairement à une expérience d’électrophorèse sur gel, le champ électrique dans une expérience de nanopore est confiné au voisinage immédiat du pore et les forces électriques agissent localement sur un court segment de l’ADN. L’intensité du champ électrique dans le pore atteint généralement ∼106 V m-1 en raison des membranes autoportantes très fines (∼60 nm). La grande longueur de persistance du λ-ADN, environ 50 nm, garantit que le segment d’ADN à l’intérieur du pore est pratiquement entièrement étendu. La situation est représentée schématiquement sur la figure 1b, où L et R représentent la longueur et le rayon du pore et ΔV le potentiel appliqué. L’ADN a une densité de charge linéaire nue λbare=-0,96 nC m-1 (2 électrons par paire de bases) et est modélisé ici comme un cylindre uniformément chargé avec un rayon a=1,1 nm. La force électrostatique nue sur le squelette de l’ADN est représentée par Fbare=λbareΔV (réf. 3). Elle est opposée à une force de traînée Fdrag causée par le mouvement électrophorétique de ses contre-ions dans la direction opposée : Fdrag est donc une composante intrinsèque du processus de translocation qui est également traçable en dernier ressort aux forces électriques5. La force nette résultante est la force électrophorétique qui conduit la translocation, donnée par Felec=Fbare-Fdrag. Dans notre cas, Felec est équilibrée par une force mécanique opposée Fmech=-Felec provenant des pinces optiques qui arrêtent l’ADN à l’intérieur du pore.

L’origine de Fdrag réside dans la distribution spatiale des ions et le profil d’écoulement du fluide correspondant. Une description à champ moyen des distributions d’ions est donnée par le formalisme de Poisson-Boltzmann, dans lequel le potentiel électrostatique est donné par et les distributions d’ions correspondantes par . Ici, λD est la longueur de Debye, est le potentiel électrostatique réduit, e est la charge élémentaire, Φ est le potentiel, kB est la constante de Boltzmann, T est la température, n est la densité numérique des ions et z est la valence de l’espèce ionique. La figure 2a montre les potentiels calculés pour deux tailles de pores obtenus par évaluation numérique de l’équation de Poisson-Boltzmann dans une géométrie cylindrique (voir la section Méthodes). Les distributions d’ions correspondantes sont présentées à la figure 2b. La couche de Debye de l’ADN est caractérisée par un appauvrissement en coions, alors que les contre-ions s’accumulent jusqu’à des densités très élevées en raison de la charge élevée de l’ADN. Comme ces distributions sont des solutions à l’équation de Poisson-Boltzmann complète (non linéarisée), l’effet de la condensation de Manning17 est inclus.

a, Potentiel électrostatique réduit pour un ‘grand’ pore (vert, R=10 nm) et un ‘petit’ pore (bleu, R=3 nm). La ligne grise indique l’emplacement de la paroi du pore pour le petit pore. La concentration en sel est cbulk=20 mM (λD=2.2 nm) et les parois des pores sont considérées comme non chargées dans ce calcul particulier pour des raisons de simplicité. b, distributions d’ions correspondantes. Dans les ‘grands’ pores (R≫λD), la distribution des ions autour de l’ADN n’est pas significativement affectée par la paroi du pore, comme l’indique l’observation que les courbes vertes atteignent la valeur globale. Cependant, dans les  » petits  » pores (R≲λD), le nuage de contre-ions (courbes solides) est comprimé par la paroi du pore et le pore peut être appauvri en coions (courbes en pointillés), laissant principalement des contre-ions positifs pour équilibrer les charges négatives de l’ADN. Cette situation est illustrée par les courbes bleues. c, Profils de vitesse du fluide calculés en combinant les résultats de a et b avec l’équation de Stokes. d, Intégrale de surface normalisée de la contrainte de cisaillement à chaque position r, calculée comme , avec τ étant la contrainte de cisaillement dans le fluide. À la surface de l’ADN, . e, potentiels de surface réduits calculés pour l’ADN (rouge) et la paroi du nanopore (gris) en fonction du rayon du pore. La zone grise représente qualitativement la région des  » petits pores « , dans laquelle les distributions d’ions sont influencées par le confinement du nanopore.

Dans notre expérience de décrochage de l’ADN, la distribution des contre-ions détermine largement le profil de vitesse de l’écoulement électro-osmotique induit. Le profil de vitesse de l’écoulement peut être calculé en résolvant l’équation de Stokes , où η est la viscosité dynamique du fluide, vz est la vitesse du fluide, Ez est le champ électrique appliqué et ρ(r) est la distribution de la charge ionique. Les profils d’écoulement du fluide calculés sont présentés sur la figure 2c. Par la suite, pour relier le profil d’écoulement à la traînée visqueuse, la contrainte de cisaillement dans le fluide est calculée comme τ(r)=-η(dvz/dr). La figure 2d montre , qui est égal au rapport Fdrag/Fbare lorsqu’il est évalué à la surface de l’ADN (r=a). Elle montre que Fdrag est du même ordre de grandeur que la force électrostatique nue agissant sur l’ADN à laquelle elle s’oppose. Fdrag est plus grande pour le plus grand pore, ce qui correspond à une plus petite force de décrochage.

Pour la comparaison avec nos expériences, il est pratique d’exprimer le modèle ci-dessus sous une forme qui relie directement la force électrophorétique aux propriétés du nanopore. Comme cela a été montré précédemment5, les équations de Poisson-Boltzmann et de Stokes peuvent être combinées pour donner une expression de la force électrophorétique sur une molécule stationnaire,

Φ(a) et Φ(R) sont les potentiels de surface de l’ADN et du nanopore, respectivement, et ε est la constante diélectrique de l’eau. et déduits de l’équation de Poisson-Boltzmann sont tracés sur la figure 2e en fonction de R. Dans les grands pores, les potentiels de surface sont indépendants de R. L’équation (1) prédit alors que la force mesurée Fmech a une dépendance simple ln-1(R/a) de la taille du pore. Dans les pores plus petits, par contre, la couche de Debye est comprimée par la paroi du pore (Fig. 2). Il en résulte une dépendance des potentiels de surface par rapport à la taille du pore et une dépendance correspondante plus compliquée de Fmech par rapport à R.

Une façon de tester directement le modèle ci-dessus est de mesurer la force de décrochage de l’ADN Fmech en fonction du rayon du pore R. Comme les travaux précédents se sont concentrés sur des pores plus petits, cependant, nous démontrons d’abord qu’il est possible de détecter la présence d’une seule molécule d’ADN dans des nanopores très grands (R≫a). La détection de l’ADN dans le pore est basée sur la mesure de l’étape de la conductance ionique ΔG lorsque l’ADN entre dans le pore. Il a été démontré précédemment que le ΔG est causé par la compétition entre deux contributions : l’exclusion de volume, qui diminue le nombre d’ions disponibles pour la conductance, et un excès de contre-ions d’ADN, qui augmente effectivement le nombre d’ions disponibles pour la conductance12. Lequel de ces deux effets domine dépend de la concentration globale de l’électrolyte, ce qui fait que le ΔG est positif (augmentation de la conductance) dans les expériences actuelles avec 20-50 mM de sel. Dans ces conditions de sel optimisées, le rapport signal/bruit de la capture d’ADN devrait être élevé, même dans les très grands pores18. Une étape typique dans le courant ainsi que le changement correspondant de la position Z de la bille sont montrés dans la Fig. 3a. Nous observons une étape claire dans le courant même si l’ADN change la conductance du nanopore de moins de 1%. Un histogramme typique des événements de capture est montré dans la Fig. 3b. Ces données montrent que nous sommes capables d’insérer et de détecter de manière contrôlable des molécules uniques même dans des nanopores avec R=45 nm, où l’ADN ne couvre que 1/2000e de la surface de section transversale du nanopore.

a, Exemple typique du courant de pore I (panneau supérieur, moyenne rouge) et de la position de la bille Z (panneau inférieur) pendant la capture de l’ADN dans un pore R=39 nm dans 33 mM KCl à 80 mV. Les mesures de courant ont été filtrées en passe-bas à 1 kHz. b, Histogramme de ΔG de 88 captures d’ADN dans le nanopore dans les mêmes conditions qu’en a. c, ΔG dans des pores de différents rayons. Les événements de capture se sont généralement produits à des tensions de 60-100 mV. La ligne pointillée horizontale est un guide pour l’œil. Triangles : 20 mM KCl, étoiles : 33 mM KCl, diamants : 50 mM KCl, étoile verte : données de b, barres d’erreur : écart-type évalué à partir des histogrammes ΔG. Les symboles ouverts représentent les données d’expériences de translocation libre sans pinces optiques.

Les valeurs ΔG déterminées expérimentalement en fonction du rayon du nanopore sont présentées dans la figure 3c pour 10 nanopores avec des rayons allant de R=3 à 45 nm. La zone grise indique la région des  » petits pores  » dans laquelle, selon les calculs de la figure 2b, les distributions d’ions près de l’ADN sont influencées par la présence de la paroi du nanopore. En apparente concordance avec les simulations, ΔG est approximativement constant dans les grands nanopores. Le ΔG plus important dans les petits nanopores est cohérent avec la compression de la couche d’écran diffus, assurant la neutralité de charge dans le pore. Une comparaison plus quantitative du ΔG mesuré avec la théorie est cependant difficile : la résistance d’accès Racc devient une contribution de plus en plus importante à la résistance totale du système dans les grands pores19, et on ignore actuellement comment la présence d’ADN enfilant dans le pore affecte Racc.

Ayant établi la faisabilité de l’arrêt et de la détection des molécules d’ADN dans les grands comme dans les petits pores, nous nous tournons maintenant vers le résultat principal de cette lettre, à savoir, la magnitude déterminée expérimentalement de la force de décrochage Fmech en fonction du rayon du nanopore R. La figure 4a montre Fmech en fonction de la tension appliquée ΔV dans les nanopores avec R=4 nm (panneau de gauche) et R=39 nm (panneau de droite). Cette relation est approximativement linéaire dans les deux cas. Cependant, Fmech/ΔV dans le petit pore est un facteur de deux plus grand que dans le grand pore. La figure 4b montre le rapport Fmech/ΔV en fonction de la taille des pores : Fmech/ΔV diminue progressivement avec l’augmentation de la taille, comme prévu sur la base de l’équation (1). La courbe en pointillés résulte de la combinaison des potentiels de surface pour la charge complète de l’ADN (Fig. 2e) avec l’équation (1), sans aucun ajustement supplémentaire. Malgré les simplifications inhérentes à un modèle unidimensionnel, le résultat théorique capture assez bien la tendance des données, bien qu’il surestime quantitativement la force de décrochage de ∼50%. Cette différence peut être attribuée à (une combinaison de) plusieurs facteurs, notamment une réduction de la mobilité des contre-ions à la surface de l’ADN12,20, ou un flux de fluide électro-osmotique supplémentaire opposé résultant de charges fixes à la surface du nanopore5. En termes d’équation (1), les deux effets peuvent être représentés par la diminution de l’ampleur de la différence de potentiel de surface ΔΦ=Φ(a)-Φ(R), réduisant ainsi l’ampleur de Fmech. En réduisant empiriquement ΔΦ de 33%, on obtient la courbe pleine de la figure 4b, un excellent ajustement aux données expérimentales. Cette réduction de ΔΦ est équivalente à environ 50% de la charge nue de l’ADN qui est blindée par des ions qui sont effectivement immobilisés sur sa surface (comme le montre la figure supplémentaire S1) ou à la présence d’une charge de surface de 15 mC m-2 sur la paroi du pore (figure supplémentaire S2). Bien que notre expérience ne permette pas de distinguer directement entre ces deux mécanismes, la densité de charge de surface déduite est typique des surfaces de SiO221. Cela suggère que la densité de charge de surface dans nos nanopores n’est pas fortement influencée par le processus de fabrication et que la charge du pore est responsable d’une partie substantielle de la correction observée.

a, Mesures de la force de décrochage en fonction du potentiel appliqué dans un petit (panneau de gauche) et un grand nanopore (panneau de droite). Dans chaque cas, deux mesures obtenues à différentes distances entre la bille et le nanopore sont montrées. b, Force mesurée en fonction du rayon du pore. Les symboles bleus et verts correspondent aux données de a. Les données dans la zone des petits pores sont tirées de la réf. 3. Les courbes représentent le résultat théorique pour la charge d’ADN nu (courbe en pointillés) et pour un ΔΦ réduit (ligne pleine, voir texte). L’encart montre schématiquement comment la force sur les contre-ions de l’ADN est divisée entre l’ADN et les parois du pore par la traînée visqueuse dans un petit et un grand pore ; la flèche jaune représente la force électrostatique nue agissant sur l’ADN. Triangles : 20 mM KCl, étoiles : 33 mM KCl, diamants : 50 mM KCl. Les barres d’erreur proviennent des incertitudes de la calibration du piège optique, qui sont estimées à 10-30% de la rigidité calibrée du piège.

Des facteurs externes non pris en compte dans notre modèle simple pourraient également affecter la valeur absolue de la force de décrochage. Par exemple, elle pourrait être biaisée par des forces électrostatiques et/ou hydrodynamiques sur la bille ou sur la partie de l’ADN résidant dans le champ électrique juste à l’extérieur du nanopore. Cependant, nos expériences ne montrent aucune preuve de tels effets, car nous n’avons détecté aucun changement dans la force de décrochage lorsque la bille était positionnée à des distances croissantes du nanopore3. En outre, les courbes force-tension expérimentales sont linéaires dans notre gamme de tension (Fig. 4a), indiquant que les forces entropiques sont faibles par rapport aux forces électrostatiques, ce qui est cohérent avec les mesures indépendantes des forces entropiques dans l’étirement de l’ADN22.

La dépendance de la force mesurée par rapport au rayon du pore dans la Fig. 4b démontre directement que la force électrophorétique dans la translocation de l’ADN est en partie déterminée par le couplage hydrodynamique entre les contre-ions de l’ADN et la paroi du nanopore. La géométrie du nanopore détermine l’ampleur de la force de traînée exercée sur l’ADN par ces contre-ions. Ce couplage a des conséquences importantes pour l’interprétation des forces déterminées expérimentalement car ces forces ne sont manifestement pas déterminées par les propriétés intrinsèques de l’ADN seul1,23.

On peut également s’attendre à des variations de la force avec l’augmentation de la concentration en sel car cela change la longueur de Debye et donc à la fois le potentiel de surface de l’ADN et vraisemblablement la force de décrochage Fmech. Cette attente est cependant compliquée par le fait que la densité de charge de surface des pores change aussi considérablement avec la concentration en sel12 et que la théorie du champ moyen utilisée ici devient peu fiable à une force ionique élevée. Dans des expériences précédentes, Fmech s’est en fait avéré être indépendant de la concentration en sel jusqu’à 1 M (réf. 3), et une interprétation de ces données basée sur un modèle dans lequel Φ(R) dépend de la concentration en sel a été suggérée par Ghosal5.

Dans la translocation libre de l’ADN, la force de restauration Fmech est absente et effectivement remplacée par une traînée de Stokes supplémentaire FStokes proportionnelle à la vitesse de la molécule. La molécule transloque à vitesse constante, la force électrophorétique étant équilibrée par FStokes. La relation entre la force de décrochage Fmech, mesurée avec les pinces optiques, et la vitesse de translocation vtrans, déterminée à partir d’expériences de translocation d’ADN libre, est donnée par4,5,14

Ce résultat est équivalent à la traînée de Stokes que subirait un cylindre non chargé se transloquant à travers un pore cylindrique à vitesse constante vtrans. Ainsi, Fmech et vtrans sont des quantités proportionnelles, liées par un facteur dépendant de la géométrie. Cette attente est qualitativement confirmée par les données expérimentales3,12, qui montrent que Fmech et vtrans sont effectivement grossièrement proportionnels. En calculant vtrans comme la longueur du contour de l’ADN λ divisée par le temps de translocation déterminé expérimentalement, on obtient vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, ce qui donne Fmech/vtrans=1,750 pN s m-1 (données pour des pores de 5-nm de rayon). L’équation (2) donne cependant une valeur de 249 pN s m-1 pour ce facteur, en utilisant η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm et a=1,1 nm. Ce chiffre est sept fois inférieur à la valeur obtenue expérimentalement. La translocation de l’ADN à travers ces pores se produit donc à une vitesse beaucoup plus faible que celle attendue à partir des forces électrophorétiques mesurées avec les pinces optiques et la description du champ moyen. Comme des nanopores similaires ont été utilisés dans toutes ces expériences, cette conclusion met en évidence une différence plus fondamentale entre la situation statique d’une molécule bloquée et la situation dynamique d’une molécule en translocation. Dans la translocation libre de l’ADN, la conformation de l’ADN à l’extérieur du pore entraîne une traînée supplémentaire sur la molécule en mouvement24, ce qui peut expliquer la divergence.

En conclusion, nous avons montré que la force électrophorétique sur une molécule d’ADN dans un nanopore dépend de la géométrie du pore. Ceci n’est pas attendu de l’électrostatique simple mais peut être compris directement en considérant la traînée hydrodynamique induite par les contre-ions criblant l’ADN en solution. Les calculs numériques basés sur les équations de champ moyen donnent une bonne description de la dépendance de la taille des pores des forces mesurées.