Articles / septembre 24, 2021

Les critères histomorphologiques de la moelle osseuse peuvent diagnostiquer avec précision la lymphohistiocytose hémophagocytaire

La lymphohistiocytose hémophagocytaire (HLH) est une maladie inflammatoire rare et multisystémique dont les critères diagnostiques sont basés sur l’essai HLH-2004. L’hémophagocytose est le seul critère histomorphologique, mais, prise isolément, elle n’est ni spécifique ni sensible pour le diagnostic de HLH. Alors que des seuils objectifs pour les critères cliniques et de laboratoire ont été établis, les critères spécifiques pour la preuve histomorphologique de l’hémophagocytose dans l’HLH n’ont pas été rigoureusement évalués ou établis. Nous avons cherché à déterminer s’il était possible d’identifier des critères numériques et objectifs pour l’hémophagocytose morphologique, et si de tels critères pouvaient aider au diagnostic de l’HLH. Nous avons analysé les caractéristiques morphologiques de l’hémophagocytose chez 78 patients présentant des caractéristiques cliniques suspectes de HLH : 40 patients avec et 38 patients sans HLH. Nous démontrons que l’érythrophagocytose non nucléée seule est un résultat non spécifique, tandis que l’hémophagocytose de granulocytes, d’érythrocytes nucléés (4 pour 1000 cellules, AUC : 0,92, 95%CI : 0,87, 0,98), et au moins un hémophagocyte contenant plusieurs cellules nucléées (AUC : 0,91, 95%CI : 0,85, 0,95) sont fortement associés à l’HLH. La modélisation conjointe des hémophagocytes contenant des granulocytes engloutis, des érythrocytes nucléés et des lymphocytes a permis de distinguer efficacement les HLH des non-HLH (AUC validée par recoupement : 0,90, IC95 % : 0,83, 0,97).

Introduction

La lymphohistiocytose hémophagocytaire (HLH) est un syndrome rare, potentiellement mortel, qui survient à la suite d’une activation immunitaire systémique sévère1. La prolifération des cellules T cytotoxiques entraîne une production accrue de cytokines et l’activation des macrophages résidant dans les tissus. En fin de compte, les lésions des organes terminaux de plusieurs systèmes causées par une inflammation massive peuvent entraîner une issue fatale en l’absence d’un diagnostic rapide et de l’instauration d’un traitement approprié.2

La lymphohistiocytose hémophagocytaire affecte des patients de tous âges et se présente comme une maladie héréditaire, ou secondairement dans le cadre de conditions prédisposantes qui altèrent la réponse immunitaire normale. La forme héréditaire de la maladie se manifeste dans la petite enfance et est associée à des mutations homozygotes dans des gènes impliqués dans l’immunité médiée par les cellules T CD8 et les cellules NK.3 Ces formes génétiques de HLH sont uniformément fatales sans transplantation de cellules hématopoïétiques ou thérapie génique. La HLH secondaire peut se produire sporadiquement chez des individus en bonne santé, mais elle est plus souvent rencontrée chez les patients atteints de malignité hématologique, de maladie auto-immune et d’immunosuppression iatrogène. On pense que pratiquement tous les cas nécessitent un déclencheur infectieux ou non infectieux pour initier la réponse immunitaire aberrante, indépendamment du dysfonctionnement immunitaire sous-jacent.74

La lymphohistiocytose hémophagocytaire se présente brusquement sur une période de plusieurs jours à plusieurs semaines avec un schéma constant de fièvre, de pancytopénie et de splénomégalie. Les anomalies de laboratoire les plus courantes sont l’hyperferritinémie, l’hypofibrinogénémie, l’hypertriglycéridémie, l’élévation du récepteur soluble de l’IL-2 et des anomalies des tests de fonctionnement du foie1. Les critères diagnostiques les plus largement utilisés pour l’HLH ont été développés pour l’inclusion dans l’essai HLH-2004, qui requiert la preuve génétique d’une mutation associée à l’HLH ou la satisfaction de 5 des 8 critères cliniques, dont la fièvre, la splénomégalie, la bicytopénie, l’hypertriglycéridémie ou l’hypofibrinogénémie, la preuve d’hémophagocytose dans la moelle osseuse ou dans d’autres tissus, une activité faible ou absente des cellules NK, une ferritine élevée et un récepteur soluble de l’IL-2 élevé3. Bien qu’ils n’aient pas été validés pour les adultes, ces critères HLH-2004 sont largement appliqués chez les patients de tous âges.

Les pathologistes jouent un rôle essentiel dans le bilan diagnostique des patients suspectés d’avoir une HLH. L’examen de la moelle osseuse est effectué pour évaluer l’hémophagocytose, identifier une malignité sous-jacente et exclure les mimiques bénignes ou néoplasiques. La présence d’une hémophagocytose dans la moelle répond à l’un des critères diagnostiques de l’HLH-2004 ; cependant, aucun seuil diagnostique accepté ni aucune directive de déclaration n’ont été établis. L’absence de directives fondées sur des preuves entraîne une incertitude considérable parmi les pathologistes quant au degré d’hémophagocytose suffisant pour satisfaire ce critère. Le fait que l’hémophagocytose ne soit pas spécifique au diagnostic de l’HLH en l’absence d’autres caractéristiques cliniques de la maladie ajoute au défi. Une érythrophagocytose rare est fréquemment observée dans les aspirats de moelle osseuse et une hémophagocytose accrue peut être rencontrée dans le cadre d’un sepsis, de transfusions sanguines, de transplantations hématopoïétiques, de chimiothérapie et du syndrome myélodysplasique118.

En raison de l’absence d’un seuil défini pour remplir le critère de diagnostic de HLH, nous avons conçu cette étude rétrospective pour interroger si les caractéristiques morphologiques quantitatives ou qualitatives de l’hémophagocytose dans les aspirats de moelle osseuse sont prédictives du diagnostic éventuel de HLH. Nous avons identifié une cohorte de patients présentant des caractéristiques cliniques préoccupantes pour une HLH et leurs aspirats ont été examinés en aveugle.

Les hémophagocytes ont été dénombrés pour 1000 cellules nucléées selon la lignée de leur contenu hématopoïétique ingéré (Figure 1). En plus des caractéristiques quantitatives, nous avons évalué une caractéristique morphologique binaire, la présence de plusieurs cellules nucléées au sein d’un seul hémophagocyte, comme une possible caractéristique prédictive de HLH.

Méthodes

Sélection des patients

Nous avons effectué des recherches dans la base de données du service d’information des laboratoires de pathologie (Powerpath) en utilisant les mots-clés suivants : « lymphohistiocytose hémophagocytaire », « hémophagocytose », « érythrophagocytose » et « HLH ». Cette recherche a donné 258 résultats entre les dates du 1er janvier 2013 et du 7 janvier 2017, et comprenait du texte provenant de n’importe quel endroit du rapport de diagnostic, y compris les informations cliniques fournies, la description microscopique, la ligne diagnostique et/ou le commentaire diagnostique (Figure 2). Les dossiers médicaux de ces patients ont été examinés par EG afin d’évaluer si une suspicion clinique de HLH était présente au moment de la ponction de moelle osseuse, soit indiquée sur le formulaire de demande d’échantillon (c’est-à-dire « exclure HLH » ou « préoccupation pour HLH ») ou listée dans le diagnostic différentiel dans le dossier médical électronique (DME) dans la semaine précédant la biopsie. Les informations démographiques, les caractéristiques cliniques, les impressions diagnostiques, les caractéristiques pathologiques et les valeurs de laboratoire au moment de la biopsie ont été recueillies pour chaque patient. Les patients ont été classés en « HLH » et « non-HLH » en fonction de l’impression diagnostique des hématologues consultants décrite dans les notes cliniques. Dans tous les cas, le diagnostic final a été déterminé sur la base des critères HLH-2004 en conjonction avec le tableau clinique général. Les patients ont été exclus de l’analyse si l’hémophagocytose a été notée de manière fortuite indépendamment de la préoccupation clinique pour une HLH, si les lames n’étaient pas disponibles pour examen, si une HLH a été envisagée mais que le diagnostic était équivoque après le bilan, ou si un antécédent documenté de traitement orienté HLH a été noté avant la biopsie. Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Stanford.

Évaluation des aspirats de moelle osseuse

Les aspirats de moelle osseuse (colorés au Wright-Giemsa) des patients HLH et non HLH ont été évalués en aveugle. Chaque lame d’aspirat a été initialement examinée à faible puissance (4x) pour identifier les zones d’hémophagocytose et sélectionner une lame appropriée pour le dénombrement des hémophagocytes. Deux cent cinquante cellules nucléées intactes ont été comptées dans chaque quadrant sur une seule lame d’aspiration par cas dans les zones présentant la plus forte densité d’hémophagocytes. Les histiocytes ont été comptés selon la lignée des cellules ingérées (GR matures, nRBCS, granulocytes et lymphocytes) et la somme des cellules progénitrices hématopoïétiques (HPC) a été calculée comme le nombre total d’histiocytes contenant des cellules hématopoïétiques ingérées. La présence de plusieurs cellules nucléées dans un seul hémophagocyte a également été notée.

Les méthodes utilisées pour l’analyse statistique sont décrites dans l’annexe supplémentaire en ligne.

Résultats

Caractéristiques des patients

Les caractéristiques des patients des 40 patients atteints de HLH et des 38 patients sans HLH sont résumées dans le tableau 1. Il n’y avait pas de différences significatives en termes d’âge ou de sexe. Les patients atteints de HLH étaient plus susceptibles de présenter une malignité sous-jacente par rapport au groupe non HLH (56 % contre 24 % ; P<0,05), le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) étant le diagnostic primaire le plus fréquent chez les patients atteints de HLH (tableaux 1 et 2). Le virus d’Epstein-Barr (EBV) était le déclencheur infectieux le plus fréquemment identifié chez les patients atteints de HLH ; 32,5% des patients du groupe HLH présentaient des signes d’infection par EBV par détection PCR dans le sang périphérique ou par immunohistochimie, contre 10.5% dans le groupe non-HLH (P<0,01).

Comme prévu, les patients diagnostiqués avec une HLH étaient plus susceptibles de présenter des résultats cliniques et de laboratoire satisfaisant chacun des critères diagnostiques HLH-2004 (tableau 1). Des différences significatives ont été observées entre les groupes HLH et non HLH dans la valeur moyenne de chaque test de laboratoire (triglycérides, fibrinogène, ferritine et IL-2r soluble) et le nombre de patients satisfaisant chaque critère HLH-2004 individuel, à l’exception de la fonction des cellules tueuses naturelles (NK). Bien que l’altération ou l’absence de test de la fonction des cellules NK soit considérée comme un outil de dépistage valide pour les patients présentant des défauts génétiques de cytotoxicité, ce test est rarement demandé chez les adultes atteints de HLH secondaire et présente un taux d’échec élevé, ce qui limite son utilité diagnostique.

L’hémophagocytose a été signalée dans le rapport diagnostique de la moelle osseuse des 40 patients atteints de HLH, contre 12 sur 38 (32%) dans le groupe non HLH (P<0,01). Bien que la preuve d’une hémophagocytose puisse être rassurante pour les cliniciens lors du diagnostic de HLH, l’hémophagocytose n’est pas obligatoire. Dans notre cohorte, la majorité des patients chez qui on a finalement diagnostiqué une HLH (73%) remplissaient 5 critères ou plus indépendamment de la présence d’une hémophagocytose dans l’aspirat de moelle osseuse (Tableau 1). Cependant, 9 patients (23%) dans le groupe HLH et 8 patients (21%) dans le groupe non-HLH remplissaient 4 critères excluant l’hémophagocytose, indiquant que l’évaluation morphologique de l’aspirat de moelle osseuse était essentielle au diagnostic chez 22% des patients présentant des caractéristiques cliniques préoccupantes pour une HLH.

Deux patients du groupe HLH ont satisfait à moins de 5 des critères HLH-2004 ; cependant, ces deux patients ont été aspléniques chirurgicalement et le reste de leurs résultats cliniques et de laboratoire, y compris la présence d’hémophagocytose sur l’aspirat de moelle osseuse, étaient compatibles avec le diagnostic. Quatre patients du groupe non HLH répondaient à 5 critères mais n’ont pas été diagnostiqués HLH. Les notes cliniques des médecins traitants indiquent que la chronicité des symptômes a été considérée comme incompatible avec une HLH. Aucun de ces patients n’avait d’hémophagocytose identifiée dans leur moelle osseuse.

Développement de modèles prédictifs pour un diagnostic morphologique de lymphohistiocytose hémophagocytaire

Les patients diagnostiqués avec une HLH (n=40) ont affiché des valeurs significativement plus élevées d’hémophagocytes totaux, et d’hémophagocytes avec l’une des lignées cellulaires (GR, nRBC, granulocytes et lymphocytes) par rapport aux patients non HLH (n=38) (P<0.001 pour toutes les lignées) (Figures 1 et 3). L’analyse de corrélation a démontré que chacun des critères cliniques et de laboratoire inclus dans les critères HLH-2004 (à l’exception de la fonction NK) présente une corrélation positive significative avec le nombre total d’hémophagocytes et d’hémophagocytes avec chacune des lignées cellulaires individuelles, ce qui indique que le degré d’hémophagocytose est en corrélation avec le diagnostic de HLH (figure supplémentaire en ligne S1).

Indépendamment les uns des autres, chaque lignage distinguait assez bien les HLH et les non-HLH. Les nRBCs ingérés et les granulocytes ingérés présentaient l’aire sous la courbe (AUC) la plus élevée, indiquant un haut degré de classification correcte des sujets HLH et non-HLH (AUC : 0,92), avec des valeurs seuils de 2 cellules ingérées et 1 cellule ingérée, respectivement. La somme des quatre lignées a également donné de bons résultats pour distinguer les sujets HLH des sujets non HLH avec une valeur seuil de 6 (AUC : 0,92, 95%CI : 0,85, 0,98).

En dichotomisant chaque lignée sur la base des valeurs seuil décrites ci-dessus et en incluant les quatre dans un arbre de décision, les hémophagocytes ingérant des granulocytes ont été choisis comme le prédicteur le plus important de HLH, suivis par les nRBC et les lymphocytes (figure 4A). Les patients qui n’avaient pas d’hémophagocytes ingérant des granulocytes avaient 3 % de chances de recevoir un diagnostic d’HLH. Les patients avec une présence d’au moins un hémophagocyte avec un granulocyte ingéré, deux hémophagocytes ou plus avec des nRBCs ingérés, et un hémophagocyte avec des lymphocytes ingérés ensemble étaient garantis d’avoir un diagnostic HLH (100% de chance). L’AUC validée par recoupement (CV) de ce CART était de 0,90 ; 95%CI : 0,83-0,97.

Identifier des lymphocytes au sein des CPS est rare, même en présence d’une HLH floride. Le nombre le plus élevé de HPC contenant des lymphocytes a été identifié chez un patient atteint de DLBCL et, sur la base de la morphologie, représentait probablement des cellules tumorales ingérées. De plus, la distinction entre les érythrocytes nucléés, les lymphocytes et les cellules souches hématopoïétiques dans le cytoplasme d’un histiocyte est difficile et sujette à des interprétations variables. C’est pourquoi nous avons créé une CART supplémentaire excluant les lymphocytes. Ce CART est identique aux deux premiers niveaux du modèle précédent, les patients ayant 92 % de chances d’avoir un diagnostic de HLH avec la présence d’au moins un hémophagocyte avec un granulocyte ingéré et deux hémophagocytes ou plus avec des nRBCs ingérés (Figure 4B). Alors que l’AUC CV était identique à celle du premier, la précision globale était légèrement supérieure dans le CART sans lymphocytes (88 % de précision CV contre 86 %).

Évaluation qualitative

La description initiale du syndrome hémophagocytaire associé au virus décrivait des histiocytes « remplis » d’éléments hématopoïétiques ingérés11. Nous observons fréquemment le phénomène de cellules nucléées multiples à l’intérieur d’histiocytes individuels chez les patients atteints de HLH établie et nous avons émis l’hypothèse que cette découverte pouvait être indicative d’un état hémophagocytaire pathologique. Pour évaluer l’importance du degré d’hémophagocytose dans les hémophagocytes individuels, nous avons analysé la présence de multiples cellules nucléées dans les histiocytes (Figure 1). Notre analyse a finalement démontré qu’au moins un hémophagocyte contenant des cellules nucléées multiples a été identifié chez 37 patients atteints de HLH contre seulement 4 patients dans le groupe non-HLH (AUC : 0,91, 0,845-0,947), ce qui indique que cette caractéristique qualitative binaire fonctionne de manière similaire aux métriques quantitatives décrites ci-dessus pour distinguer les patients atteints de HLH des patients non-HLH (tableau 3).

Discussion

Etant donné la rareté du diagnostic et la présentation clinique non spécifique, l’HLH est un diagnostic difficile pour les cliniciens et les pathologistes. Une fois considéré dans le différentiel, un bilan rapide comprenant l’évaluation de chacun des critères HLH-2004 est couramment poursuivi, car une intervention thérapeutique précoce améliore les résultats chez ces patients souvent gravement malades. Malheureusement, il n’y a pas de seuil défini pour satisfaire le critère diagnostique d’hémophagocytose dans la moelle osseuse et des directives fondées sur des preuves pour rapporter les résultats n’ont pas été établies.

Dans ce but, nous avons conçu cette étude rétrospective pour déterminer si les caractéristiques quantitatives de l’hémophagocytose au moment de l’évaluation initiale de la moelle osseuse sont prédictives du diagnostic final de HLH chez les patients présentant des caractéristiques cliniques concernant le diagnostic. Étant donné que l’HLH se présente classiquement avec une cytopénie multi-linéaire qui est censée résulter de la consommation de cellules hématopoïétiques par des macrophages activés,12 nous pensions que les patients atteints d’HLH seraient plus susceptibles de présenter une hémophagocytose d’érythrocytes nucléés, de granulocytes et de lymphocytes par rapport aux patients sans HLH. En plus d’évaluer les différences quantitatives possibles dans l’hémophagocytose, nous avons simultanément évalué la présence de plusieurs cellules nucléées dans un seul hémophagocyte comme une caractéristique morphologique binaire candidate qui pourrait différencier les patients avec une hémophagocytose pathologique.

Dans l’ensemble, nous avons constaté que les patients atteints de HLH affichaient un nombre significativement plus élevé de CPS par chacune des lignées examinées (tableau 3). Nous avons également identifié des seuils quantitatifs qui peuvent être utilisés pour diagnostiquer avec précision la plupart des cas de HLH : un granulocyte ou deux cellules érythroïdes nucléées pour 1000 cellules nucléées. De plus, nous avons utilisé l’analyse de classification et d’arbre de régression pour identifier la meilleure combinaison de variables afin de créer un modèle encore plus spécifique et prédictif pour discriminer les patients atteints de HLH. Enfin, nous avons montré que la présence de plusieurs cellules nucléées au sein d’un seul hémophagocyte était un facteur prédictif supplémentaire d’un diagnostic de HLH parmi les patients présentant des résultats cliniques préoccupants pour la maladie.

La description initiale du syndrome hémophagocytaire associé à un virus (VAHS) décrivait une hémophagocytose floride dans 19 cas de patients immunodéprimés et précédemment sains présentant des caractéristiques cliniques compatibles avec une HLH11. Dans 60 aspirats de moelle osseuse consécutifs utilisés à des fins de comparaison, ils ont trouvé une érythrophagocytose dans 29 cas sur 60 ; cependant, le degré de phagocytose n’était « jamais d’un degré à confondre avec le VAHS ». Cette étude menée avant le développement des critères HLH-2004 a fourni les premières preuves de l’association de l’hémophagocytose avec le VAHS (ce que nous appellerions aujourd’hui HLH), et a montré que la découverte d’une érythrophagocytose est fréquemment identifiée dans les aspirats de moelle osseuse de patients sans HLH, démontrant un manque de spécificité dans l’isolement des résultats cliniques.

Nous avons procédé à une évaluation similaire en aveugle de 87 aspirats de moelle osseuse provenant de patients présentant des tumeurs malignes myéloïdes et lymphoïdes de novo et post-traitement, des cytopénies bénignes et des moelles de stadification négatives, et avons identifié une érythrophagocytose prédominante des GR matures dans 39% de ces cas. En appliquant à cet ensemble de données le seuil quantitatif déterminé par notre analyse pour les GR non nucléés engloutis (érythrophagocytes), nous constatons que seuls 3 des 87 patients (5 %) satisfont à ce critère morphologique (4 pour 1000 cellules). De même, si nous appliquons le seuil quantitatif des granulocytes (1 pour 1000 cellules), seuls 4 des 87 patients (4%) répondraient à ce critère morphologique. Par conséquent, bien que nous puissions effectivement trouver de rares exemples d’érythrophagocytose dans les frottis d’aspiration d’une grande minorité de cas, l’application de seuils quantitatifs révèle une faible incidence d’hémophagocytose cliniquement significative dans une pop ulation de patients qui reflète celles rencontrées dans la pratique diagnostique de routine.

Une étude récente de Ho et al. a examiné la spécificité de l’hémophagocytose pour la HLH en quantifiant la quantité absolue d’hémophagocytose identifiée dans les aspirats de moelle osseuse des patients dont le rapport de pathologie diagnostique décrivait une hémophagocytose10. Ils ont démontré que la présence d’une hémophagocytose, même lorsqu’elle est présente en quantité élevée, n’est pas spécifique de l’HLH. Notre expérience institutionnelle est cohérente avec leur conclusion selon laquelle une hémophagocytose significative n’est pas prédictive du diagnostic de l’HLH en l’absence de caractéristiques cliniques préoccupantes pour la maladie ; cependant, la présence d’une hémophagocytose substantielle est une découverte relativement rare. Une hémophagocytose fortuite a été signalée dans 86 des 8097 (1,1 %) rapports de biopsies de moelle osseuse internes à l’hôpital universitaire de Stanford entre 2013 et 2017. La majorité des rapports indiquent une hémophagocytose » rare » (61 %), tandis que les autres décrivent une hémophagocytose » dispersée « , » occasionnelle » ou » vive « . Un sous-ensemble (n=12) de ces derniers cas a été examiné. Les 12 cas ont tous démontré une érythrophagocytose. La moitié des cas présentent des granulocytes ingérés et 3 cas présentent de multiples cellules nucléées dans les CPS individuels. Aucun de ces patients n’a finalement reçu un diagnostic de HLH.

L’une des principales limites de cette étude est sa nature rétrospective. Notre population est limitée aux patients chez qui le diagnostic clinique a été évalué de manière approfondie et une détermination définitive a été faite concernant le diagnostic de HLH. Nous avons exclu les patients chez qui le diagnostic final était ambigu. De plus, bien que notre cohorte comprenne tous les patients de notre institution qui répondaient aux critères d’évaluation, y compris les enfants, un seul patient de notre cohorte présentait une mutation homozygote diagnostiquant une HLH primaire, ce qui limite l’applicabilité de nos résultats aux patients présentant des formes génétiques de la maladie. Enfin, nous notons que si le test CD107a a été décrit comme un test plus sensible pour la HLH primaire,13 ce test récemment développé n’a pas été utilisé dans cette cohorte rétrospective.

En définitive, le diagnostic de HLH repose sur l’évaluation approfondie des patients dans le contexte clinique approprié. De même, l’examen microscopique des frottis d’aspiration de moelle osseuse chez les patients suspectés d’être atteints d’HLH nécessite une évaluation minutieuse de la présence d’hémophagocytose. Nos résultats démontrent que les seuils quantitatifs de la lignée des cellules ingérées, seuls ou en combinaison, permettent de prédire avec précision le diagnostic éventuel de HLH. Nous démontrons également que l’identification d’un seul hémophagocyte contenant plusieurs cellules hématopoïétiques nucléées dans son cytoplasme fonctionne de manière similaire à notre approche quantitative. Avec une validation externe et une étude prospective plus poussée, nous espérons que ces données permettront de fournir une méthode aux pathologistes et aux cliniciens pour évaluer systématiquement et classer avec précision les patients atteints de HLH et contribuer à l’établissement de directives consensuelles de diagnostic et de déclaration.

Notes de bas de page

↵* BAM et RSO ont contribué à parts égales à ce travail.
Vérifiez la version en ligne pour les informations les plus récentes sur cet article, les suppléments en ligne et les informations sur les divulgations de la paternité & : www.haematologica.org/content/103/10/1635

Reçu le 17 décembre 2017.
Accepté le 13 juin 2018.

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