L’électroacupuncture atténue le stress oxydatif hépatique et rénal chez les rats anesthésiés

13 -.ARTICLE ORIGINAL
METABOLISME

L’électroacupuncture atténue le stress oxydatif du foie et des reins chez les rats anesthésiés1

L’électroacupuntura atenua o estresse oxidativo no fígado e no rim em ratos anestesiados

Agamenon Honório SilvaI ; Lanese Medeiros FigueiredoI ; Paulo Araujo DiasI ; Alberico Ximenes do Prado NetoII ; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII ; Sérgio Botelho GuimarãesIV

Fellow Master Degree, Département de chirurgie, Programme de troisième cycle, UFC, Ceara, Brésil. Procédures techniques, acquisition et interprétation des données. L’article fait partie d’un mémoire de maîtrise (AHS)
IIGrâce à un étudiant de troisième cycle, UFC, Ceara, Brésil. Aide aux procédures techniques, acquisition des données
IIIPhD, professeur associé, coordinateur, programme de troisième cycle, département de chirurgie, UFC, Ceara, Brésil. Révision critique et interprétation des données
IVPhD, professeur associé, département de chirurgie, chef, LABCEX, UFC, Ceara, Brésil. Tuteur, conception, design, contenu intellectuel et scientifique de l’étude, rédaction du manuscrit, analyse statistique

Correspondance

ABSTRACT

Objectif : étudier les effets d’une seule séance d’électroacupuncture (EA) aux acupoints Zusanli (ST-36) et Zhongwan (CV-12) combinés dans la régulation du stress oxydatif dans le foie et les reins chez les rats anesthésiés.
Méthodes : Dix-huit rats sains répartis au hasard en 3 groupes (n=6) ont été anesthésiés par voie intrapéritonéale avec de la kétamine (90mg kg-1 de poids corporel) + xylazine (10mg/kg de poids corporel) : G-1 : contrôle (anesthésie), G-2 : anesthésie+EA10Hz et 10 mA, 10 Hz) appliquée aux acupoints droits ST-36 et CV-12 pendant 30 minutes. G-3 a été traité de la même manière, en utilisant une fréquence dix fois plus élevée (100 Hz). L’activité G6PDH, les niveaux de malondialdéhyde (MDA) et de glutathion (GSH) ont été dosés par spectrophotométrie.
RESULTATS : Les concentrations de MDA et de GSH dans le foie ont augmenté de manière significative chez les rats soumis à l’EA 10Hz (p<0,01) et à l’EA 100Hz (p<0,001), par rapport au contrôle G-1. L’activité de la G6GPH dans le foie et les reins a diminué de manière significative dans les groupes G-2 (p<0,01) et G-3 (p<0,001) par rapport au groupe G-1 chez les rats soumis à l’EA100Hz. Un schéma similaire a été trouvé dans l’activité G6PDH rénale chez les rats EA10Hz.
CONCLUSION : Une seule séance de 30 minutes d’EA 10/100Hz améliore la peroxydation lipidique et réduit simultanément le stress oxydatif dans les tissus du foie et des reins dans un modèle de rat.

Mots-clés : Acupuncture. Electroacupuncture. Peroxydation lipidique. Stress oxydatif. Rats.

RESUMO

OBJETIVO : Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) aplicada nos acupontos Zusanli (E-36) e Zhongwan (RM-12) simultaneamente, na regulação do estresse oxidativo no fígado e rins em ratos anestesiados.
MODES : Dix-huit rats sains, répartis aléatoirement en trois groupes (n = 6), ont été anesthésiés à la kétamine (90mg/kg de poids corporel) + xylazine (10mg/kg de poids corporel) : G-1 : contrôle (anesthésie), G-2 : anesthésie + EA10Hz et G-3 : anesthésie + EA100Hz. Les rats du groupe G-2 ont été soumis à une EA (ondes carrées pulsées, 10 mA, 10 Hz) appliquée aux acupoints droits ST-36 et VC-12 pendant 30 minutes. Chez les rats du groupe G-3, une fréquence 10 fois supérieure (100 Hz) a été utilisée. L’activité de l’enzyme G6PDH et les concentrations de malondialdéhyde (MDA) et de glutathion (GSH) ont été vérifiées par spectrophotométrie.
RESULTATS : Les concentrations hépatiques de MDA et de GSH étaient significativement augmentées chez les rats soumis à l’AE en utilisant 10Hz (p <0,01) et 100Hz (p <0,001), par rapport au contrôle. L’activité G6GPH a été significativement diminuée dans les groupes G-2 (p <0,01) et G-3 (p <0,001) dans le foie et les reins par rapport au groupe G-1 chez les rats traités avec 100Hz.
CONCLUSION : Une seule séance d’EA 10/100Hz pendant 30 minutes augmente la peroxydation lipidique et réduit simultanément le stress oxydatif dans le foie et les reins de rats sains.

Descripteurs : Acupuncture. Electroacupuncture. Peroxydation des lipides. Stress oxydatif. Rats.

Introduction

L’acupuncture manuelle (AM) est l’une des principales formes de traitement en médecine traditionnelle chinoise. Elle implique l’utilisation d’aiguilles fines et pointues qui sont insérées dans le corps à des endroits très spécifiques (acupoints). L’AM est utilisée depuis plusieurs millénaires dans les pays orientaux et est de plus en plus acceptée par les praticiens et les patients en Occident également1. L’électroacupuncture (EA) est une modification de cette technique où de petits courants électriques sont appliqués à des aiguilles préalablement insérées dans le corps et semble donner des résultats plus régulièrement reproductibles dans de nombreux contextes cliniques et de recherche spécifiques2-4. L’EA appliquée à l’acupoint Zusanli (ST-36) a réduit la peroxydation lipidique dans des modèles expérimentaux d’ischémie/reperfusion tels que la moelle épinière5, le cerveau6 et le sérum sanguin7 du rat et le muscle cardiaque du porc8.

Chakrabarti et al.9 ont étudié l’effet d’un traitement unique, aigu (7 impulsions/seconde, 0,75 volt) et chronique (4 impulsions/seconde, 0,75 volt) d’électroacupuncture à des jours alternés pendant une période de 21 jours sur les fonctions hépatiques des rats. Deux acupoints du dos ainsi que le ST-36 ont été utilisés. Après un traitement chronique, la valeur de peroxydation des lipides microsomaux du foie a diminué de manière significative. De plus, étant donné que la stimulation manuelle de l’acupoint ST-36 est capable d’atténuer les lésions rénales induites par la septicémie10, il est possible que la stimulation électrique de cet acupoint puisse modifier les concentrations de MDA, un indicateur de lésions de la membrane cellulaire, dans le tissu rénal.

Les processus physiologiques sont régulés par des enzymes. Le NADPH est le principal réducteur intracellulaire et sa production dépend principalement de la glucose-6-phosphate déshydrogénase. Si l’activité de la G6PDH est inhibée, on observe une diminution simultanée de l’activité du NADPH, une coenzyme essentielle à la protection contre les dommages oxydatifs. L’intégrité des cellules ainsi que l’ensemble du système antioxydant dépendent d’un apport adéquat de NADPH11. De nombreux articles ont démontré les effets de la MA et de l’EA sur l’acupoint ST-36 dans l’atténuation du stress oxydatif dans différentes maladies expérimentales5-9. En outre, l’utilisation de la kétamine+xylazine, un mélange anesthésique souvent utilisé dans les études expérimentales peut induire un certain degré de stress oxydatif chez un animal sain12-13.

Il a été démontré précédemment que de grandes quantités de peptides opioïdes endogènes sont sécrétées par les glandes surrénales lorsque les acupoints CV-12 sont stimulés par acupuncture à 2Hz14. Lorsqu’une EA à haute fréquence (15 Hz) a été appliquée pour stimuler l’acuponcture CV-12, de multiples sources de peptides opioïdes endogènes ont été découvertes15. Par conséquent, nous avons voulu étudier si l’application d’EA, stimulant à la fois les acupoints ST36 et CV-12, en utilisant deux fréquences différentes, 10 Hz et 100 Hz, peut modifier la teneur en MDA et GSH du foie et des reins et s’il existe une différence dans la peroxydation lipidique et le stress oxydatif entre l’EA 10 Hz et 100 Hz chez les rongeurs en bonne santé.

Méthodes

Préparation des animaux

Des rats Wistar mâles pesant 280-400 g, fournis par la Faculté de médecine Small Animals Breeding Facility (Université fédérale du Ceara) ont été maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (24°C _humidité relative 40%-60%, cycles alternés lumière-obscurité de 12 heures, nourriture et eau ad libitum). L’équivalent des acupoints ST-36 et CV-12 de la droite humaine a été choisi pour les aiguilletages et la stimulation électrique. La nomenclature des acupoints utilisée suit celle de l’OMS16. L’acupoint ST-36 est situé à 5 mm sous la tête du péroné, sous l’articulation du genou, et à 2 mm latéralement par rapport à la tubérosité antérieure du tibia. La ponction de l’acupoint ST-36 stimule le nerf cutané sural latéral, la branche cutanée du nerf saphène, et plus profondément, le nerf péronier profond17-18. L’acupoint CV-12 est situé sur la ligne médiane antérieure de la partie supérieure de l’abdomen, à 20 mm sous le synchondrosis sternal. Cette région est innervée par la branche cutanée antérieure du 8e nerf intercostal18.

Matériels

Des aiguilles jetables en acier inoxydable (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Corée) ont été utilisées. L’électrostimulateur EL-608 a été acheté auprès de NKL Produtos Eletrônicos Ltda, Brusque, Santa Catarina, Brésil.

Groupes expérimentaux

Les animaux ont été anesthésiés par voie intrapéritonéale avec un mélange fraîchement préparé de kétamine (90mg kg/poids corporel) et de xylazine (10mg kg/poids corporel). Les rats ont été répartis au hasard en 3 groupes égaux comme suit :

* Groupe 1 (anesthésie) – 6 rats

* Groupe 2 (EA 10Hz) – 6 rats

* Groupe 3 (EA 100Hz) – 6 rats

Groupe 1 (contrôle) les rats ont été anesthésiés comme décrit. Soixante minutes plus tard, l’abdomen des rats a été ouvert et le foie et les reins droits ont été retirés. Les rats du groupe 2 (EA10Hz) ont été anesthésiés comme décrit. Après une désinfection de routine de la peau avec de l’éthanol à 75 %, des aiguilles jetables stérilisées en acier inoxydable (0,25 mm × 30 mm) ont été insérées perpendiculairement à une profondeur de 2 à 3 mm au niveau des acupoints ST-36 et CV-12 droits. Des électrodes ont été connectées aux deux aiguilles et à un électrostimulateur (NKL EL-608) ; des ondes carrées pulsées, 10 Hz, 10 mA ont été appliquées pendant 30 minutes. Des échantillons ont été prélevés 30 minutes plus tard. Les rats du groupe 3 (EA100Hz) ont été soumis à l’EA comme le groupe 2. Cependant, une fréquence dix fois supérieure (100 Hz) a été utilisée.

Déterminations biochimiques

Les paramètres déterminés comprenaient l’activité G6PDH, les concentrations de malondialdéhyde (MDA) et de glutathion (GSH). Les échantillons de tissus ont été congelés dans l’azote liquide et conservés dans des tubes de verre à -70º jusqu’à la préparation et l’analyse ultérieures des homogénats de foie et de rein. La peroxydation lipidique a été évaluée en mesurant le malondialdéhyde comme substance réactive au TBA19. En bref, du H3PO4 (1%, 3 mL) et une solution aqueuse de TBA (0,6%, 3 mL) ont été ajoutés à l’homogénat à 10% (0,5 mL). Le milieu d’essai a été agité et chauffé sur un bain d’eau bouillante pendant 45 min. Après refroidissement, 4 mL de n-butanol ont été ajoutés et le mélange a été agité. Après séparation de la couche de n-butanol par centrifugation à 1200g pendant 15 min, sa densité optique a été déterminée dans un spectrophotomètre (Beckman DU 640 B ; Beckman Instruments, maintenant Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) avec 535 et 520 nm comme longueurs d’onde d’absorption, respectivement. La différence entre les résultats des deux déterminations de la densité optique a été considérée comme la valeur de l’ATB et la quantité de malondialdéhyde (MDA) dans le testicule a été calculée, comparée aux normes de MDA et exprimée en micromoles de MDA par gramme de tissu humide. Les niveaux de GSH ont été estimés par la méthode de Sedlak et Lindsay20 qui est basée sur la réaction entre les groupes thiol et l’acide 5-5-dithiobis-(2-nitrobenzoïque) pour produire un composé qui absorbe la lumière à 412 nm. La quantité de GSH a été déterminée à partir d’une courbe standard obtenue simultanément dans les mêmes conditions avec différentes concentrations de GSH. Les activités G6PDH ont été estimées par des méthodes décrites précédemment21. L’activité enzymatique a été lue par spectrophotométrie.

Analyse des données

Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) a été utilisé pour les calculs et l’analyse statistique. Tous les résultats ont été exprimés en moyenne±SD. La distribution de toutes les données a été testée (test de Kolmorogov-Smirnov avec valeur P de Dallal-Wilkinson-Lilliefor). Une ANOVA à sens unique ou un test de Kruskal-Wallis, selon le cas, ont été réalisés pour déterminer les différences entre les groupes en ce qui concerne les concentrations de MDA et de GSH et l’activité de la G6PDH dans les tissus hépatiques et rénaux. Dans l’analyse post hoc (Tukey ou Dunn), une valeur de probabilité de p<0,05 a été considérée comme indiquant une signification statistique.

Résultats

Dosage GSH

Les concentrations de GSH dans le foie ont augmenté de manière significative chez les rats soumis à l’EA 10Hz et à l’EA 100Hz (p<0,001), par rapport au contrôle (Figure 1). Des augmentations similaires des concentrations de GSH dans les reins ont été observées dans les groupes EA10Hz et EA100Hz (Figure 2). En outre, les concentrations de GSH du foie et des reins ont augmenté de manière significative chez les rats traités par EA100Hz par rapport au groupe EA10Hz.

Dosage de la MDA

Les concentrations de MDA du foie ont augmenté de manière significative chez les rats soumis à EA10Hz (p<0,01) et EA100Hz (p<0,001), par rapport au groupe témoin (Figure 3). Des augmentations similaires des concentrations de MDA dans les reins se sont produites dans les groupes EA10Hz et EA100Hz (Figure 4). Les concentrations de MDA dans les reins ont augmenté de manière significative dans le groupe EA100Hz par rapport au groupe EA10Hz.

Dosage G6PDH

L’activité G6GPH du foie a diminué de manière significative dans les groupes EA100Hz (p<0,001) par rapport au groupe témoin (Figure 5). Un schéma similaire a été trouvé dans l’activité G6PDH rénale chez les rats EA10Hz. L’activité G6PDH rénale n’était pas différente dans les deux groupes (Figure 6).

Discussion

Dans notre expérience, le stress oxydatif a été induit par l’utilisation de la kétamine, un agent anesthésique dissociatif, souvent utilisé soit lors de procédures vétérinaires, soit à des fins expérimentales. Alva et al.12 ont démontré que la kétamine entraîne une augmentation des niveaux d’oxyde nitrique plasmatique, induit une acidose métabolique et provoque des dommages oxydatifs, sans toutefois atteindre la toxicité hépatique.

Les effets antiperoxydants de l’EA basse fréquence ont été démontrés. Siu et al.6 ont électrostimulé les acupoints GB-20, situés sur la face postérieure du cou, sous l’os occipital, dans la dépression entre le muscle sternocléidomastoïdien et le muscle trapèze et le ST-36, en utilisant plusieurs applications avant une ischémie cérébrale et ont conclu que l’EA à 2Hz pouvait partiellement réguler la peroxydation lipidique dans l’ischémie cérébrale. Le GB-20 et le ST-36 avaient une efficacité bénéfique similaire6. Dans notre étude, l’utilisation de l’EA a induit une augmentation significative de la concentration de MDA dans le foie (Figure 3) et le rein (Figure 4) dans les groupes EA10Hz et EA100Hz. Une augmentation supplémentaire de la peroxydation lipidique s’est produite dans le groupe EA100Hz par rapport aux rats EA10Hz. Ceci suggère que le rein est plus sensible à la peroxydation lipidique que le foie. Il semble que l’utilisation d’une stimulation électrique utilisant des fréquences élevées en une seule séance augmente la peroxydation des lipides dans ce modèle de rat.

Yu et al.22 ont évalué le rôle de la stimulation par aiguille de quatre acupoints différents : GB-34 (Yanglingquan), LR-3 (Taichong), ST-36 (Zusanli) et SP-10 (Xuehai) acupoints sur la régulation du stress oxydatif dans le système nigrostriatal chez le rat lésé par la 6-hydroxydopamine et ont conclu que la stimulation par acupuncture empêchait la réduction du niveau de GSH ainsi que l’augmentation du niveau de MDA.

Comme nous avons étudié les effets d’une seule séance d’électroacupuncture alors que dans Yu et al.22 ont évalué les effets du traitement classique d’acupuncture, effectué deux fois par jour pendant 14 jours ; nous pensons que l’utilisation de la stimulation électrique en une seule séance pourrait être responsable de l’augmentation des niveaux de MDA. D’autre part, l’EA utilisée en une seule séance a induit une augmentation significative de la concentration de GSH dans les tissus du foie (Figure 1) et des reins (Figure 2). L’effet protecteur de l’EA est plus important à des fréquences plus élevées comme le démontre l’augmentation de la concentration de GSH dans le rein des rats EA100Hz, par rapport aux animaux EA10Hz.

La G6PDH joue un rôle très important dans la réponse cellulaire au stress oxydatif. Jusqu’à récemment, on croyait généralement que l’importance de cette enzyme était limitée aux érythrocytes humains qui ne possèdent aucune autre voie de production de NADPH23. Des observations récentes ont montré que la G6PDH joue un rôle protecteur contre les espèces réactives de l’oxygène dans les cellules eucaryotes qui possèdent des voies alternatives pour la production de NADPH24. Dans cette étude, l’activité G6PDH a diminué de manière significative dans le foie des groupes EA10Hz et EA100Hz. Une baisse similaire de l’activité a été observée dans le rein des rats EA10Hz. Les concentrations rénales de GSH ont augmenté chez les rats EA100Hz au moment où une diminution concomitante de la G6PDH a été mise en évidence dans le même groupe.

Yu et al.25 ont démontré que l’activation de la G6PDH est inversement corrélée aux niveaux intracellulaires de GSH, en utilisant des cultures de suspension cellulaire de Taxus chinensis. Il est possible que les cellules animales aient un comportement similaire.

En ce qui concerne les forces et les faiblesses de cette étude par rapport à d’autres, il n’existe aucune étude publiée qui puisse être directement comparée à la présente recherche. Malgré le fait que les effets peroxydatifs de l’EA ont été démontrés ici, contrairement à d’autres études6, l’électrostimulation de 10 Hz n’a pas été utilisée par d’autres chercheurs. Les études publiées ont utilisé l’EA à basse fréquence (2 Hz), en plusieurs séances. Dans notre étude, une seule séance a été utilisée. Par ailleurs, la diminution de l’activité de la G6PDH dans le foie et les reins des rats traités avec 100 Hz et 10 Hz, respectivement, ainsi que l’augmentation concomitante des niveaux de GSH, après une seule séance d’EA, suggèrent que des fréquences plus élevées pourraient induire une meilleure protection contre le stress oxydatif. Les mécanismes impliqués ne sont pas encore clairs. Des études supplémentaires pourraient apporter un nouvel éclairage sur les effets protecteurs de l’électroacupuncture.

Conclusion

Les données recueillies soutiennent l’hypothèse selon laquelle une seule séance d’EA 10/100Hz de 30 minutes augmente la peroxydation lipidique et réduit simultanément le stress oxydatif en augmentant les niveaux de GSH dans les tissus du foie et des reins dans un modèle de rat.

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