Guanidine

Protéines membranaires

La guanidine et les solutions SDS sont des solvants dénaturants mais nous voulions, bien sûr, caractériser également les états natifs des protéines membranaires. La difficulté ici était qu’il n’y avait pas encore de consensus sur la façon de définir ou de concevoir l’état natif – ce qui, pour les nouveaux venus comme nous, se traduisait par une incertitude, car nous n’avions pas le genre d’expérience qui nous permettrait de deviner avec perspicacité laquelle des idées en lice était susceptible de s’avérer correcte.

Même la bicouche phospholipidique, le seul concept indispensable à la compréhension la plus minimale des membranes cellulaires, était encore contestée, malgré le fait qu’elle avait été démontrée pour la première fois dans les globules rouges près de 50 ans auparavant et qu’elle était vraiment le seul arrangement concevable sur la base de la thermodynamique, une conséquence directe des mesures classiques d’Irving Langmuir en 1917 avec des monocouches de substances amphiphiles. J’ai décrit l’acceptation ridiculement lente du concept de bicouche dans l’intervalle dans mon livre Ben Franklin Stilled the Waves . Le point ici est que le scepticisme persistait encore lorsque nous nous sommes impliqués dans la recherche sur les membranes.

Et parmi ceux qui étaient convaincus de la bicouche lipidique, le mode d’incorporation des protéines dans les membranes était encore sujet à débat. Certains, comme notre collègue de Duke David Robertson, étaient réticents à l’idée que les protéines puissent réellement pénétrer ou traverser une bicouche. Deux images conceptuelles assez disparates, tirées d’une conférence à l’Académie des sciences de New York en 1972, sont présentées à la figure 3 . L’une est la « membrane unitaire » de Robertson avec les protéines totalement à l’extérieur. L’autre donne la vision de Vanderkooi des complexes cytochrome oxydase dans les membranes mitochondriales : la protéine est positionnée de façon plus réaliste, mais il n’y a pas encore de conception de domaines hydrophiles et hydrophobes distincts et de la façon dont ils pourraient dicter l’interaction protéine-lipide. Plus tard, au cours de cette même année 1972, l’image idéalisée désormais conventionnelle des bicouches phospholipidiques, avec des protéines fonctionnelles qui les traversent de part en part, a finalement été popularisée par le modèle de « mosaïque fluide » de Singer et Nicolson.

Fig. 3. Deux images conceptuelles disparates des protéines membranaires, toutes deux proposées lors de la même réunion à New York en 1972 : (a) Robertson pensait que les protéines seraient disposées de façon asymétrique, à l’extérieur des deux surfaces bicouches ; (b) la vue de Vanderkooi des complexes cytochrome oxydase en coupe transversale.

Dans le laboratoire, c’était une époque passionnante, la plus passionnante dont je me souvienne. Nous avons appris à utiliser des détergents bénins qui, contrairement au SDS, pouvaient solubiliser les protéines membranaires sans dénaturation grossière, dans un environnement simulant l’état natif, mais un environnement où elles seraient également facilement accessibles pour la caractérisation moléculaire – une avancée dans laquelle nous avons été en partie anticipés par deux sympathiques jeunes hommes de Finlande, Kai Simons et Ari Helenius .

Dans la pratique, nous étions encore le plus souvent cantonnés à mesurer le poids moléculaire et à demander combien de chaînes polypeptidiques par molécule, mais les protéines auxquelles s’adressaient ces questions avaient été séparées par traitement détergent des autres composants membranaires. Plus important encore, beaucoup de ces protéines avaient une fonction cellulaire connue et nos mesures étaient pertinentes pour ces fonctions. J’ai déjà mentionné les globules rouges, mais nous avons en fait réussi à couvrir un éventail de sujets biologiquement pertinents, stimulés dans de nombreux cas par le zèle missionnaire des étudiants. Par exemple, un étudiant diplômé en physiologie, Stuart Grefrath, qui s’intéressait à la neurophysiologie, est venu dans notre laboratoire pour dénombrer les chaînes polypeptidiques d’une membrane excitable – en l’occurrence le nerf olfactif de l’orphie – et cela nous a conduits à nous intéresser par la suite à plusieurs autres systèmes de transport actifs . (Stuart lui-même est malheureusement décédé à la suite d’une maladie cardiovasculaire congénitale avant d’avoir pu réaliser ses promesses précoces avec une carrière indépendante). La myéline cérébrale était une autre membrane du système nerveux sur laquelle nous nous sommes penchés .

Il faut également souligner la présence de deux visiteurs du laboratoire qui ont choisi de travailler ensemble : Neal Robinson, un boursier postdoctoral, et Leon Visser, qui était en congé sabbatique du CSIR à Pretoria, en Afrique du Sud). Ils ont fait un travail très soigné de définition quantitative de la structure de domaine du cytochrome b5, une sorte de prototype pour illustrer comment les protéines membranaires sont attachées aux membranes et continuent à remplir leur fonction dans le cytoplasme adjacent .

Dans d’autres projets, nous répondions à des demandes de collègues éloignés. J’ai déjà mentionné le travail avec Arthur Karlin sur le récepteur d’acétylcholine d’un poisson électrique. Un autre exemple était la bactériorhodopsine, pour laquelle nous avons fait des mesures dans une solution détergente à la demande de Walter Stoeckenius de l’Université de Californie . Une question importante se posait ici, liée au mécanisme de l’activité de pompage des protons de cette protéine : la protéine native est-elle fonctionnellement un monomère ou (comme certaines données semblaient le suggérer) un trimère ? Notre protéine solubilisée était incontestablement un monomère et les preuves spectrales indiquaient qu’elle passait par le même cycle de changements moléculaires que dans la membrane native.

Dans la plupart des cas, nous n’avons pas nous-mêmes été directement impliqués pour essayer de comprendre le fonctionnement des récepteurs, des pompes ou des canaux, mais nous avons inévitablement pris conscience des problèmes. C’était une expérience vraiment enrichissante, bien différente de l’époque où l’albumine sérique et la β-lactoglobuline (obtenues auprès de fournisseurs commerciaux) étaient les cibles principales de nos recherches.

Dans le cas des pompes ioniques, nous sommes effectivement entrés dans la physiologie, principalement au niveau de l’hypothèse ou de la théorie ; nous avons appris à modéliser des schémas cinétiques avec un ordinateur ; nous avons assisté aux conférences appropriées ; etc. Notre dernier congé sabbatique – à l’Institut Max Planck de Heidelberg – a été important à cet égard. Le président du département de physiologie de Duke, Ted Johnson, s’est joint à nous à cette occasion, de sorte que nous étions trois à collaborer activement. Ted était un passionné d’informatique depuis longtemps et avait connecté chaque membre de la faculté de physiologie à l’installation informatique centrale du North Carolina Research Triangle avant qu’il ne devienne à la mode de dépenser les fonds du département de cette manière. À l’époque, nous devions écrire nos propres programmes pour l’ordinateur, ce qui était difficile pour moi, mais je crois que nous avons obtenu des résultats utiles, principalement sur des modèles cinétiques pour le cycle de pompage de la pompe Na,K entraînée par l’ATP. Nous avons travaillé à des heures peu orthodoxes, y compris les week-ends et les jours fériés, ce qui a parfois déconcerté nos hôtes de Heidelberg, qui avaient l’habitude d’éteindre le chauffage central lorsque le laboratoire était censé être inoccupé. Tous les dix jours environ, nous traversions la frontière en voiture jusqu’à Strasbourg pour un déjeuner gastronomique – accompagné de vins alsaciens, dont nous apprécions le goût depuis.