Gamma-Glutamyl Transpeptidase

Activité et spécificité

Par conséquent, la réaction catalysée par cette enzyme est généralement comprise comme le transfert d’un groupe γ-glutamyle à une variété de molécules acceptrices telles que l’eau, les acides aminés, les dipeptides et le donneur de γ-glutamyle lui-même, selon les conditions de la réaction. Ces propriétés catalytiques sont associées au mécanisme catalytique de la GGT, dans lequel la réaction se déroule par un mécanisme de double déplacement d’acylation-désacylation via un intermédiaire γ-glutamyl-enzyme.

Comme prévu à partir des structures du substrat naturel glutathion et de ses dérivés, la GGT reconnaît strictement la partie γ-glutamyle, mais a une spécificité de substrat assez large par rapport au groupe partant (Xaa). Le glutathion, ses S-conjugués, le disulfure de glutathion, les γ-glutamyl di- ou tripeptides, la glutamine, les dérivés l-α-méthyl des γ-glutamyl amides, le leucotriène C4, les dérivés poly-γ-glutamyl sont tous acceptés comme substrats . Les substrats artificiels tels que le l-γ-glutamyl-p-nitroanilide (l-γ-Glu-pNA) et la l-γ-glutamyl-7-amino-4-méthylcoumarine (l-γ-Glu-AMC) fluorescente sont des substrats actifs couramment utilisés en présence ou en l’absence d’accepteurs de γ-glutamyl (voir ci-dessous) pour le dosage de la transpeptidase ou de l’hydrolase, respectivement.

La spécificité du substrat par rapport à l’accepteur est la plus étudiée avec la GGT du rein de rat . Les isomères l d’acides aminés neutres tels que l-cystine, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys et l-Ser sont de bons accepteurs, mais les acides aminés hydrophobes et à chaîne ramifiée tels que l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile et l-Val sont des substrats plutôt pauvres. Les acides aminés d-Amino et les acides aminés α-substitués ne jouent pas le rôle de substrats accepteurs. Par conséquent, l’utilisation de d-γ-Glu-pNA est un moyen pratique de supprimer l’autotranspeptidation lors de la mesure de l’activité hydrolase. Étant donné que le site de liaison de l’accepteur chevauche les sous-sites pour la fraction Cys-Gly du glutathion, l’enzyme préfère les dipeptides avec Gly à l’extrémité C-terminale tels que l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly et l-Ser-Gly comme substrats accepteurs dans l’ordre décroissant de l’activité relative. Les peptides comportant plus de deux résidus d’acides aminés sont de très mauvais accepteurs. Les valeurs Km des acides aminés et des dipeptides accepteurs sont relativement élevées, comprises entre 0,1 et 5 mM, mais le Gly-Gly (Km=3 mM) est le plus facilement utilisé comme substrat accepteur pour l’activité transpeptidase. Des concentrations élevées de molécules acceptrices inhibent la GGT de manière compétitive par rapport au donneur de γ-glutamyle (γ-Glu-Xaa), probablement en raison du chevauchement du site de liaison de Xaa et de celui de l’accepteur. La spécificité du substrat par rapport au sous-site Cys dépend de l’origine de l’enzyme ; l’enzyme E. coli, par exemple, préfère les acides aminés basiques (l-Arg, l-Lys et l-His) et les acides aminés aromatiques (l-Phe, l-Trp et l-DOPA) à ce site. Cependant, la spécificité de l’accepteur doit être prise avec précaution, car l’activité apparente dépend également de la concentration effective de l’acide aminé déprotoné disponible au pH concerné. L’activité relativement élevée observée avec Gly-Gly est due en partie au faible pKa de ce dipeptide. Les groupes aminés déprotonés des substrats accepteurs semblent être nécessaires à la transpeptidation.

Le substrat donneur le plus largement utilisé pour le dosage enzymatique est le l-γ-Glu-pNA. Un mélange de dosage typique pour l’activité transpeptidase de l’enzyme du rein de rat consiste en 5 mM de l-γ-Glu-pNA, 100 mM de Gly-Gly dans du Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) à 25°C. L’ajout d’une concentration suffisante de Gly-Gly supprime efficacement l’hydrolyse et l’autotranspeptidation. Le pH optimal de la GGT est d’environ 7,5-9 pour la transpeptidation, mais la dépendance du pH est beaucoup plus faible pour l’hydrolyse. Ceci est cohérent avec le fait que l’activité transpeptidase apparente dépend, en partie, de la concentration effective du groupe amino libre des accepteurs .

L’activité hydrolase pour la glutamine est augmentée jusqu’à 12 fois par l’ajout de modulateurs dirigés vers le site accepteur tels que le maléate, l’hippurate et le glycocholate. L’ajout de ces composés inhibe la liaison des substrats accepteurs et des donneurs de γ-glutamyle qui occupent les sous-sites Cys-Gly. L’ajout de donneurs de γ-glutamyle ou la liaison d’inhibiteurs au site donneur de γ-glutamyle augmente l’affinité de ces modulateurs, ce qui indique des interactions coopératives entre les sites de liaison des donneurs de γ-glutamyle et des accepteurs (pour une revue, voir Tate & Meister ). Le site accepteur occupé par ces modulateurs est suggéré pour promouvoir un changement de conformation de la GGT en une forme active, facilitant ainsi la formation d’un état de transition. Ceci est également proposé pour expliquer l’augmentation du taux d’inactivation des enzymes de mammifères par l’acvicine (vide infra), mais ceci n’a pas été observé avec l’inhibition par un γ-monofluorophosphonate, un marqueur d’affinité analogue à l’état de transition dirigé vers le site actif . L’acicvicine semble se lier à un résidu nucléophile autre que le nucléophile catalytique de la GGT des mammifères .

La GGT est inhibée de manière réversible et compétitive par le l- et le d-γ-glutamyl-(o-carboxy)phénylhydrazide (anthglutine, produite par Penicillium oxalicum) avec un Ki de 8 μM, et aucune toxicité aiguë n’est signalée pour les souris . Plusieurs analogues du glutamate avec un groupe réactif près du γ-carboxy agissent comme des inhibiteurs irréversibles. La 6-diazo-5-oxo-l-norleucine (DON), la O-diazoacétyl-l-sérine (l-azaserine) et l’acide l-(αS,5S)-α-amino-3-chloro-4,5-dihydro-5-isoxazoleacétique (acivicine ou AT-125, produit par Streptomyces sviceus) sont des inactivateurs puissants, mais non spécifiques de la GGT . L’acivicine a été largement utilisée pour supprimer l’activité de la GGT in vivo, bien que l’acivicine soit hautement toxique car elle inactive un certain nombre de glutamine amidotransférases impliquées dans la biosynthèse des nucléotides, des acides aminés et des sucres aminés. Le complexe sérine-borate se lie de manière réversible au site de liaison γ-glutamyle pour inhiber la GGT avec un Ki de 20 μM . Cette découverte classique a conduit à un inhibiteur puissant et à liaison lente, l’acide l-2-amino-3-boronobutanoïque (γ-boroGlu) . La GGT est inhibée avec un Ki global de 17 ou 35 nM, mais l’inhibition reste réversible. L’acide 2-amino-4-(fluorophosphono)butanoïque (γ-PFGlu), un analogue du glutamate dont le γ-carboxy est remplacé par un phosphore électrophile, est un puissant agent de marquage par affinité de la GGT d’E. coli, basé sur un mécanisme et dirigé vers le site actif. Ce composé inhibe rapidement et irréversiblement la GGT pour former un adduit stable, anionique et tétraédrique semblable à un état de transition, qui se prête à la cartographie peptidique pour identifier le nucléophile catalytique de la GGT d’E. coli (voir ci-dessous). Une série d’analogues de glutamate γ-(monophényl)phosphono- et γ-phosphonodiester servent d’inhibiteurs basés sur un mécanisme qui inhibe la GGT de manière irréversible par modification covalente de son nucléophile catalytique. En particulier, les γ-phosphonodiesters qui incorporent la mimique structurelle de Cys-Gly et son groupe carboxy C-terminal présentent des activités extraordinairement élevées envers la GGT humaine, la vitesse d’inactivation étant 130 à 6000 fois plus rapide que celle de l’acvicine. L’inhibition est sélective pour la GGT, et aucune toxicité n’est observée. L’un de ces inhibiteurs est disponible commercialement sous le nom de ‘GGsTop’ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Un inhibiteur analogue non glutamate de la GGT humaine est trouvé par criblage à haut débit . Ce composé occupe le site accepteur du complexe γ-glutamyl substrat avec un Ki de 17,6 μM. L’inhibiteur est sélectif en fonction de l’espèce, mais il est réversible et une certaine toxicité est signalée.

On pense que la réaction catalysée par la GGT se déroule selon un mécanisme ping-pong via un intermédiaire γ-glutamyl-enzyme, comme cela est observé avec les sérine hydrolases . Le Thr Oγ N-terminal de la petite sous-unité est le nucléophile catalytique auquel est fixé un groupe γ-glutamyle (voir Chimie structurale). Le nucléophile catalytique de la GGT a été identifié pour la première fois avec la GGT d’E. coli comme le résidu Thr N-terminal (Thr391) de la petite sous-unité par cartographie peptidique de l’enzyme inactivée par le γ-PFGlu . Ce résidu, correspondant à Thr380 (enzyme du rein de rat) et Thr381 (enzyme humaine), est conservé parmi toutes les GGT dont les séquences primaires sont connues. Le nucléophile catalytique de la GGT humaine est identifié comme Thr381 par cartographie peptidique de l’enzyme inactivée par le marqueur d’affinité γ-(monophényl)phosphono . Par conséquent, la réaction catalysée par la GGT commence par l’attaque nucléophile du résidu Thr N-terminal de la petite sous-unité sur le γ-carboxy d’un substrat donneur (γ-Glu-Xaa) pour éliminer Xaa. L’enzyme γ-glutamyl ainsi formée réagit avec l’eau (hydrolyse) ou avec des acides aminés et des dipeptides (transpeptidation et autotranspeptidation) dans l’étape déterminant le taux .

La GGT est un membre des hydrolases nucléophiles N-terminales (Ntn-hydrolases) comme prédit à partir de son pli unique et du processus de maturation, dans lequel une forme dimère active de l’enzyme mature est générée par un traitement autocatalytique post-traductionnel du précurseur catalytiquement inactif. Ceci est confirmé par la mutagenèse dirigée par site et l’analyse structurale aux rayons X des enzymes bactériennes (voir Chimie structurale).