EzColocalization : Un plugin ImageJ pour visualiser et mesurer la colocalisation dans les cellules et les organismes

Vue d’ensemble du flux de travail EzColocalization

Le flux de travail pour EzColocalization est divisé en quatre modules, chacun ayant son propre onglet sur l’interface graphique. Les onglets sont : (i) « Entrées » où les images, les masques ou les listes de régions d’intérêt (ROI) sont sélectionnés et alignés ; (ii) « Filtres de cellules » où les cellules peuvent être sélectionnées sur la base de caractéristiques physiques et de l’intensité du signal ; (iii) « Visualisation » où les cartes de chaleur, les diagrammes de dispersion et les matrices métriques (définies ci-dessous) sont créés ; et (iv) « Analyse » où les métriques de colocalisation et les sorties sont choisies. Il n’est pas nécessaire d’utiliser tous les modules et tous les processus d’un module. Certains onglets ont un bouton « Preview » pour exécuter un module spécifique au lieu du bouton « Analyze » qui exécute tous les processus sélectionnés dans tous les modules.

Inputs

Les fichiers images, qui sont choisis dans l’onglet « Inputs » (Fig. 1A), doivent être : (i) monochromatiques (c’est-à-dire pas aux formats RVB ou CMJN) ; (ii) 8 bits, 16 bits ou 32 bits ; et (iii) dans un format tel que TIFF qui conserve les valeurs d’intensité des pixels d’origine. Les images de grande taille peuvent être compressées pour le transfert de fichiers en utilisant un format sans perte tel que ZIP ou LZW, puis décompressées pour les analyses. En plus des images, EzColocalization peut accepter des masques et des listes de ROI pour l’identification des cellules (voir ci-dessous). S’il y a plusieurs images pour chaque canal, les images doivent être empilées pour une analyse plus efficace dans le menu « Stack » (voir le guide ImageJ pour plus de détails24). Les images d’une pile peuvent être des champs de vue différents ou une série temporelle, mais doivent avoir les mêmes dimensions, le même grossissement et le même ordre d’image pour chaque canal. L’onglet d’entrée fournit également des options permettant de définir des seuils pour l’intensité du signal et d’aligner des images mal alignées provenant de différents canaux (Fig. 1B et Informations supplémentaires). Des recommandations pour l’acquisition d’images appropriées pour l’analyse de la colocalisation sont fournies dans les informations supplémentaires. Remarque : l’alignement fonctionne sur l’hypothèse qu’un seuil approprié pour l’intensité du signal peut être choisi pour distinguer les pixels à l’intérieur et à l’extérieur des cellules ; si le seuillage inclut des zones à l’extérieur de la cellule ou seulement une zone limitée à l’intérieur des cellules, alors l’alignement peut ne pas fonctionner correctement. Pour cette raison, tous les alignements doivent être vérifiés visuellement en examinant les ROI pour confirmer que les zones cellulaires appropriées sont sélectionnées.

EzColocalization est principalement conçu pour un canal « identification cellulaire » et deux ou trois images de canal « rapporteur ». Cependant, il peut fonctionner avec d’autres combinaisons d’entrées (tableau S1). Le canal d’identification cellulaire est utilisé pour identifier les cellules individuelles, et par conséquent pour distinguer les pixels intracellulaires et extracellulaires. Le canal d’identification cellulaire peut être constitué de n’importe quel type d’image permettant d’identifier les limites des cellules, notamment : des images de microscopie optique (par exemple, contraste de phase25,26 et champ clair), des images avec un rapporteur qui marque la membrane cellulaire ou qui est présent dans tout le cytoplasme (par exemple, Cy5, figure 1B), et des images avec un colorant extracellulaire qui délimite les cellules. Les images de contraste interférentiel différentiel (DIC) créent des ombres qui rendent difficile la sélection automatisée des cellules à l’aide de méthodes à seuil27 ; par conséquent, pour les images DIC, nous recommandons de créer des ROI à l’aide des  » outils de sélection  » d’ImageJ pour délimiter manuellement les zones cellulaires, puis de les ajouter à une liste en choisissant  » Add to Manager  » (dans le sous-menu  » Selection  » du menu  » Edit « ). Une fois que les ROIs de toutes les cellules d’intérêt dans une image sont sélectionnés, un masque binaire peut être créé en utilisant les fonctions « Clear Outside » et « Autothreshold » d’ImageJ.

Cell Filters

L’onglet « Cell Filters » est utilisé pour aider à sélectionner les cellules dans les images (Fig. 2A) et distinguer les pixels intracellulaires et extracellulaires. Les cellules sont identifiées en : (i) choisissant l’un des algorithmes de seuil d’ImageJ24, ou en sélectionnant manuellement les seuils (ce qui est fait en sélectionnant « *Manuel* » dans une liste déroulante dans l’onglet Entrées et en appuyant sur le bouton « Afficher le(s) seuil(s) »), pour identifier les régions correspondant aux cellules dans le canal d’identification des cellules (Fig. 2B) ; (ii) l’utilisation de la segmentation par bassin versant pour séparer les objets qui se touchent dans les images du canal d’identification cellulaire (facultatif) (Fig. 2B) ; (iii) la sélection d’objets dans les images du canal d’identification cellulaire en fonction de paramètres physiques (Fig. 2C) et de l’intensité du signal (Fig. 2D). EzColocalization tentera de détecter automatiquement si les images d’entrée ont un arrière-plan sombre ou clair en utilisant l’asymétrie. En supposant qu’il y a plus de pixels dans le fond que dans les cellules, une image avec une asymétrie positive indique un fond sombre et une asymétrie négative indique un fond clair. Les utilisateurs peuvent également choisir manuellement si les images d’entrée ont un fond sombre ou clair dans les options « Paramètres… » du menu « Paramètres ». Les cellules qui ne sont que partiellement à l’intérieur d’une image, et qui pourraient donc fournir des valeurs trompeuses, sont automatiquement supprimées des analyses.

EzColocalization dispose d’un « filtre pré-bassin versant » optionnel et de huit filtres post-bassin versant optionnels (avec la possibilité d’en sélectionner davantage). Segmentation de bassin versant peut aider à la séparation des cellules de division et de toucher28, mais il peut également diviser de grands objets tels que les agrégats de matériel extracellulaire en fragments plus petits qui sont la même taille que les cellules. Pour éviter ce dernier cas, le filtre Pre-watershed peut être utilisé pour exclure de l’analyse les objets présentant de grandes surfaces. Le bouton Preview de l’onglet Cell Filters permet aux utilisateurs de voir quels objets de l’image actuelle seront sélectionnés lorsque les limites minimales et maximales de tous les filtres seront ajustées. Il existe deux classes de paramètres pour les filtres cellulaires post-bassin versant (tableau S2) : (i) les paramètres physiques basés sur les mesures du canal d’identification des cellules ; et (ii) les paramètres d’intensité du signal provenant des canaux rapporteurs. Les paramètres physiques s’appliquent à tous les canaux, tandis que les paramètres d’intensité du signal ne s’appliquent qu’au canal rapporteur pour lequel ils sont sélectionnés (car les rapporteurs peuvent avoir des niveaux de signal très différents). En plus du filtrage basé sur les options prédéfinies dans ImageJ, EzColocalization dispose de filtres pour le « MeanBgndRatio » ou le « MedianBgndRatio », qui sont calculés en divisant l’intensité moyenne ou médiane du signal des pixels à l’intérieur d’un objet par l’intensité moyenne ou médiane respective du signal des pixels extracellulaires.

Visualisation

L’onglet « Visualisation » affiche les signaux ou les métriques dans les cellules sous forme de : (i) des « cartes de chaleur » ; (ii) des diagrammes de dispersion ; et (iii) des « matrices métriques » (Fig. 3A).

Les cartes de chaleur sont des images pseudo-couleurs qui montrent l’ampleur relative des signaux des rapporteurs (Fig. 3B). Elles sont générées par normalisation et remise à l’échelle afin que les valeurs minimales et maximales des pixels soient respectivement de 0 et 255 dans chaque cellule, image ou pile. Il existe huit options pour colorer les cartes de chaleur, et les valeurs d’intensité pour chaque couleur sont obtenues à partir de la fonction « Show LUT » (dans le sous-menu « Color » du menu « Image » dans ImageJ). Les cartes thermiques cellulaires permettent de déterminer où chaque rapporteur est présent avec la plus forte intensité dans les cellules. Les cartes thermiques d’images peuvent montrer si différentes cellules dans un champ de vision ont des intensités sensiblement différentes, ce qui peut indiquer une hétérogénéité biologique ou une irrégularité dans le marquage. Les cartes thermiques de piles peuvent montrer si les cellules de différentes images ont des niveaux d’intensité de signal sensiblement différents, ce qui peut indiquer une irrégularité dans le marquage ou les mesures sur une lame (par exemple, en raison du photoblanchiment) ou des changements dans le signal au fil du temps (si la pile est une série chronologique). Remarque : l’apparence des cartes thermiques est affectée par les paramètres de luminosité et de contraste.

Les diagrammes de dispersion montrent la relation entre l’intensité du signal pour deux ou trois canaux rapporteurs pour des cellules et des images individuelles (figure 3C). Cette relation est importante pour choisir la métrique de colocalisation appropriée (Informations supplémentaires). Les diagrammes de dispersion peuvent également révéler une hétérogénéité dans les schémas de localisation8, ce qui peut nécessiter l’élimination des pixels de fond ou des analyses séparées pour différents types de cellules.

Les matrices métriques fournissent une vue d’ensemble des schémas de localisation en montrant les valeurs calculées d’une métrique de colocalisation pour de nombreuses combinaisons de seuils. Les matrices métriques pour le score de chevauchement de seuil (TOS) se sont avérées utiles pour l’analyse des modèles de localisation pour deux canaux rapporteurs8,15 (Fig. 3D). Pour être complet, EzColocalization a l’option de calculer des matrices métriques pour deux canaux rapporteurs à l’aide de cinq autres métriques : score de chevauchement de seuil avec mise à l’échelle logarithmique8, coefficient de corrélation de Pearson (PCC), coefficients de colocalisation de Manders (M1 et M2), coefficient de corrélation de rang de Spearman (SRCC) et quotient de corrélation d’intensité (ICQ)8,15. La colocalisation pour trois canaux peut également être mesurée à l’aide de l’ICQ, des coefficients de colocalisation de Manders et du TOS29 (Informations supplémentaires).

Les seuils pour toutes les métriques sont mesurés comme le percentile supérieur (FT) des pixels pour l’intensité du signal8,15. Par exemple, FT = 0,1 correspond aux 10 % de pixels présentant le signal le plus élevé. Pour les matrices métriques, FT est également utilisé pour spécifier la taille du pas pour les combinaisons de seuils. C’est-à-dire que FT = 0,1 sélectionne également les seuils pour les 10 %, 20 %, … et 100 % des pixels présentant le signal le plus élevé. Si FT n’est pas divisé par 100, alors le pourcentage restant est le dernier pas. Pour les métriques qui ne nécessitent pas de seuil (c’est-à-dire PCC, SRCC et ICQ), les valeurs sont calculées en supposant que seuls les pixels au-dessus des seuils existent. La fenêtre de la matrice métrique dispose d’options permettant d’enregistrer les résultats sous forme de texte ou d’image, de modifier la FT ou le type de métrique, de visualiser les valeurs métriques des cellules individuelles sous forme de liste et de calculer la moyenne, la médiane ou le mode de la métrique pour chaque combinaison de seuils. Le bouton « Proc » (traité) et « Raw » détermine si la liste de données affichée, copiée ou sauvegardée avec les boutons « List », « Copy » ou « Save… » respectivement est la valeur moyenne de l’échantillon pour chaque combinaison de seuil (par exemple, la valeur médiane) ou toutes les valeurs de chaque cellule de l’échantillon pour toutes les combinaisons de seuil.

Analysis

L’onglet « Analysis » a trois sous-onglets (« Analysis Metrics », « Metrics Info » et « Custom »). Le sous-onglet « Analysis Metrics » comporte six métriques pour mesurer la colocalisation pour deux rapporteurs (Fig. 4A) et trois métriques pour trois rapporteurs (voir section précédente). Les utilisateurs peuvent choisir un seuil ou aucun seuil pour PCC, SRCC et ICQ. Les coefficients de colocalisation de TOS et Manders doivent avoir un seuil pour être calculés. Le sous-onglet Info métrique contient des informations et des ressources sur les métriques utilisées dans le sous-onglet Métriques d’analyse (plus de détails dans les Informations supplémentaires). Les seuils peuvent être sélectionnés à l’aide de la méthode de Costes30 ou manuellement. Dans le sous-onglet Custom (voir Informations supplémentaires pour plus d’informations), les utilisateurs peuvent écrire leur propre code en JavaTM pour analyser les images (remarque : l’exemple fourni est pour le calcul du PCC) (Fig. 4B). Le bouton « Compiler » teste le code et crée un fichier temporaire dans le répertoire temporaire de Java et affiche le résultat de la compilation avec une étiquette « Succeeded » ou « Failed ». En cas de succès, le code personnalisé compilé est relu en mémoire et appliqué aux cellules sélectionnées.

La sortie de chaque analyse est un tableau qui spécifie l’image et un numéro d’identifiant pour chaque cellule (Fig. 4C), et pour chaque cellule, des valeurs sont fournies pour : (i) la métrique sélectionnée ; (ii) les paramètres physiques ; et (iii) l’intensité moyenne du signal pour chaque canal (si sélectionné). Note : « NaN » dans le tableau de sortie indique l’échec du calcul d’une valeur. Les utilisateurs peuvent également générer des fenêtres récapitulatives (avec le numéro de cellule, la moyenne, la médiane et l’écart-type pour la métrique sélectionnée) (Fig. 4D), des histogrammes des valeurs métriques (Fig. 4E), des images de masques binaires et une liste de ROIs qui représentent la position et le numéro de chaque cellule sur chaque image dans le gestionnaire de ROIs. Les listes de ROI et les images de masque binaire peuvent être enregistrées pour une nouvelle analyse des mêmes cellules.

Applications d’EzColocalization

EzColocalization est conçu pour être utilisé de manière modulaire afin de faciliter la personnalisation des analyses pour une grande variété d’expériences et de besoins des chercheurs. Cette section se concentre sur la démonstration d’outils spécifiques dans EzColocalization pour résoudre des problèmes du monde réel dans divers ensembles d’images.

Dans la première application d’EzColocalization, des images de neurones hippocampiques de rat provenant de la bibliothèque d’images de cellules (CIL:8773, 8775-8788, qui sont attribuées à Dieter Brandner et Ginger Withers) sont utilisées pour démontrer : (i) l’utilisation d’un canal rapporteur pour l’identification des cellules lorsqu’une expérience ne dispose pas d’images non-reporters distinctes pour l’identification des cellules ; (ii) les filtres de cellules pour sélectionner les cellules ; et (iii) les outils de visualisation pour choisir les métriques. Le déroulement de l’analyse est décrit dans la figure 5A. Dans la première étape, deux piles d’images rapporteurs ont été créées : une pile avec des images où la F-actine est marquée (en utilisant un peptide de phalloïdine conjugué à la rhodamine) ; et la seconde pile avec des images où la tubuline est marquée (en utilisant un anticorps conjugué à Alexa 488) (Fig. 5B). L’interaction entre la F-actine et la tubuline est importante pour la croissance et la migration des neurones31,32. Nous avons utilisé les images de F-actine pour l’identification des cellules car elle est présente dans toutes les cellules et elle montre les limites des cellules8. Les cellules individuelles ont été sélectionnées à partir des images de F-actine en appliquant un seuil pour identifier les cellules24 et en utilisant un filtre cellulaire pour éliminer les débris cellulaires (note : valeurs des paramètres dans la figure 5A).

Après la sélection des cellules, l’intensité des signaux des rapporteurs a été examinée en utilisant des cartes de chaleur cellulaires et des diagrammes de dispersion. Nous avons constaté que les rapporteurs ne se colocalisaient pas à des niveaux de signal élevés et qu’il existait une relation complexe entre les intensités de signal (Fig. 5C,D). En raison de ce dernier point, la localisation a été quantifiée en utilisant M1 et M2 de Manders et TOS (Informations supplémentaires). M1 et M2 ont été évalués aux seuils sélectionnés par la méthode de Costes pour la cellule décrite dans la Fig. 5B, et les valeurs étaient respectivement de 0,289 et 0,995. Ces valeurs sont généralement interprétées comme indiquant que la tubuline a une forte colocalisation avec la F-actine, et que la F-actine a une faible colocalisation avec la tubuline. Les valeurs TOS ont été évaluées en générant une matrice métrique avec les valeurs médianes TOS. La matrice a montré la colocalisation, l’anticolocalisation et la non-colocalisation à différents seuils pour les intensités de signal de la tubuline et de la F-actine (Fig. 5E). Aux sites des cellules où la F-actine et la tubuline ont le signal d’intensité la plus élevée (10% supérieurs des pixels pour chaque canal), la valeur médiane du TOS est de -0,36 (n = 20). Cette valeur négative indique une anticolocalisation, ce qui est cohérent avec l’impression obtenue à partir des cartes de chaleur et des nuages de points, et avec d’autres rapports8.

Dans la deuxième application, des images de Saccharomyces cerevisiae subissant une mitose ont été obtenues à partir de la bibliothèque d’images de cellules33 pour démontrer : (i) l’identification des cellules via des contours dessinés à la main (pour les expériences où les méthodes automatisées d’identification des cellules ne peuvent pas être appliquées) ; et (ii) l’alignement des images. Les entrées des rapporteurs étaient une image d’une souche de type sauvage (« contrôle » ; CIL : 13871) qui possède la protéine BFA1 qui charge TEM1 sur le corps du pôle fuseau, et une image d’une souche sans la protéine BFA1 (∆bfa1 deletion mutant ; CIL : 13870). Dans ces images rapporteurs, les cellules expriment la protéine TEM1 fusionnée à la GFP et l’ADN a été marqué avec du DAPI (4′, 6-diamidino-2-phénylindole). TEM1 se localise aux corps des pôles du fuseau pendant la mitose et est impliqué dans le déclenchement de la sortie de la mitose33. Le flux de travail est illustré à la figure 6A. Dans cette application, les ROIs ont été dessinés manuellement autour des cellules en utilisant l’outil de sélection « Freehand » dans ImageJ sur des images DIC. Les masques binaires, qui ont été utilisés pour sélectionner les zones cellulaires, ont été créés en sélectionnant les ROI et en utilisant les fonctions  » Clear Outside  » puis  » Auto Threshold  » d’ImageJ24 (Fig. 6B). Les zones cellulaires ont été utilisées pour l’identification des cellules et pour corriger l’alignement entre les images DIC et les canaux rapporteurs en utilisant l’algorithme de seuil « Default » (Fig. 6C). Après cette identification des cellules et cet alignement des images, les images sont maintenant prêtes à être visualisées et analysées comme décrit dans l’exemple précédent.

Dans la troisième application, des images de Caenorhabditis elegans adultes entiers obtenues à partir de la Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 ont été utilisées pour démontrer que : (i) EzColocalization peut analyser la colocalisation dans des organismes entiers ; et (ii) les filtres « cell » peuvent sélectionner des organismes individuels en fonction de l’intensité du signal du rapporteur. Les images de cet exemple proviennent du même ensemble de données utilisé dans notre étude décrivant le TOS (mais ce ne sont pas les mêmes images)8. Le flux de travail est illustré à la figure 7A. Les contours de chaque C. elegans ont été dessinés dans ImageJ sur des images en champ clair pour créer des ROIs, et les ROIs ont été ajoutés au gestionnaire de ROI pour l’identification des « cellules ». La GFP exprimée par le promoteur clec-60 dans l’intestin antérieur était le rapporteur 1 et le mCherry exprimé par le promoteur myo-2 dans le pharynx, qui est un organe voisin de l’intestin antérieur35, était le rapporteur 2. Les filtres cellulaires pour les paramètres physiques n’étaient pas nécessaires car seuls les objets considérés comme convenant à C. elegans avaient des contours dessinés autour d’eux en premier lieu. En revanche, les filtres cellulaires pour l’intensité du signal étaient nécessaires car certains C. elegans présentaient un faible signal GFP, peut-être en raison de l’extinction du transgène36,37 (figure 7B). La visualisation et l’analyse ultérieures peuvent être effectuées comme décrit dans la première application.

Dans la quatrième application, nous démontrons l’analyse de la colocalisation pour trois canaux rapporteurs. Le flux de travail était le même que pour deux canaux rapporteurs, sauf que  » 3 canaux rapporteurs  » a d’abord été sélectionné dans le menu principal  » Paramètres  » (figure 8A). Les images ont été obtenues à partir de la Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Version 1, Image set : 37983, image : p23_s9) de cellules cancéreuses osseuses U2OS (n = 66)38. Les trois images reporters présentaient l’ADN, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries respectivement colorés avec le Hoechst 33342, le conjugué concanavaline A/Alexa Fluor488 et le MitoTracker Deep Red (rangée supérieure, Fig. 8B). L’identification des cellules a été réalisée à l’aide d’une image de la membrane plasmique marquée avec le conjugué agglutinine de germe de blé (WGA)/Alexa Fluor 555 (en haut à gauche, Fig. 8B). Remarque : l’image comportait également le marquage de l’appareil de Golgi et du réseau de F-actine38. La membrane plasmique a été tracée à l’aide de l’outil de sélection de polygone dans ImageJ pour créer des ROI pour les cellules individuelles, et le gestionnaire de ROI contenant les ROI a été sélectionné pour l’identification des cellules.

Les modèles de localisation ont été visualisés de la même manière que pour deux reporters, sauf que : (i) il y a trois ensembles de cartes thermiques pour les reporters au lieu de deux (rangée inférieure, Fig. 8B) ; et (ii) les nuages de points et les matrices métriques sont en trois dimensions (Fig. 8C-F). Dans l’onglet Visualisation et dans l’onglet Analyse (Fig. 8G), il est possible de mesurer la colocalisation des trois rapporteurs à l’aide des métriques ICQ, TOS ou M1, M2 et M3 de Manders. Parmi les trois mesures, nous avons trouvé que TOS était la plus facile à interpréter. Le TOS a une seule valeur pour mesurer la colocalisation des trois signaux des rapporteurs, et il a clairement montré que les signaux des rapporteurs pour le noyau, les mitochondries et le RE se chevauchaient à des seuils bas (c’est-à-dire qu’à des valeurs élevées de FT, il y a colocalisation ; couleur rouge dans la Fig. 8E) et ne se chevauchaient pas à des seuils élevés (c’est-à-dire qu’à des valeurs basses de FT, il y a anticolocalisation ; couleur bleue dans la Fig. 8E). Ces observations sont cohérentes avec le noyau, les mitochondries et les organites ER se chevauchant à leurs bords (où le signal de leurs rapporteurs est généralement plus faible) en raison d’interactions physiques connues, mais pas à leurs centres (où le signal de leurs rapporteurs est généralement plus élevé) parce qu’ils sont des structures distinctes dans les cellules39,40,41.