Echovirus 4 associé à la maladie des mains, des pieds et de la bouche

VIROLOGIE

Echovirus 4 associé à la maladie des mains, des pieds et de la bouche

Echovirus 4 associé à la doença de mão, pé e boca

Denise Hage Russo ; Adriana Luchs ; Bráulio Caetano Machado ; Rita de Cássia Carmona ; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Laboratoire des virus entériques, Institut Adolfo Lutz, São Paulo, SP, Brésil

Correspondance à

Sommaire

La maladie des mains, des pieds et de la bouche (MFPB) est une infection entérovirale contagieuse survenant principalement chez les enfants et caractérisée par des éruptions palmoplantaires vésiculaires et une stomatite érosive. L’échovirus 4 (EV-4) a été fréquemment associé à la méningite aseptique. L’association de l’HFMD avec l’EV-4 n’a pas été rapportée auparavant. Deux échantillons d’un enfant de 14 mois qui présentait une fièvre légère, des plaies dans la bouche, une éruption cutanée avec des cloques sur la paume des mains et la plante des pieds ont été envoyés au Laboratoire des virus entériques de l’Institut Adolfo Lutz. Les échantillons cliniques ont été inoculés dans trois lignées cellulaires différentes, et ceux qui présentaient un effet cytopathique (ECP) ont été soumis à un test d’immunofluorescence indirecte (IFA) et à une RT-PCR en une étape. L’électrophorèse sur gel d’agarose du produit de la RT-PCR a montré un produit de 437 pb, caractéristique du groupe des entérovirus. L’Echovirus 4 a été identifié par IFA. Bien que l’HFMD soit une infection virale associée principalement à l’Enterovirus 71 (HEV-71) et au Coxsackievirus A16 (CV-A16), nos résultats démontrent une diversité de sérotype liée à l’HFMD et soulignent l’importance de la surveillance épidémiologique à cette maladie et à ses complications.

Mots clés : Maladie de la main, du pied et de la bouche ; Entérovirus ; Echovirus.

RESUMO

Une Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) é uma infecção enteroviral contagiosa que ocorre principalmente em crianças sendo caracterizada por erupções palmoplantares vesiculares e estomatite. Echovirus 4 (EV-4) est souvent associé à la méningite épileptique. L’association de DMPB par EV-4 n’a pas été décrite précédemment. Deux échantillons provenant d’un enfant de 14 mois présentant de la fièvre, des sécrétions de la gorge et des éruptions cutanées sur les paumes des mains et des pieds ont été envoyés au laboratoire des virus entériques de l’Instituto Adolfo Lutz. Les échantillons ont été inoculés dans trois lignées cellulaires différentes ; ceux qui présentaient un effet cytopathique (ECP) ont été soumis à un test d’immunofluorescence indirecte (IFI) et à une RT-PCR en une étape. L’électrophorèse sur gel d’agarose réalisée avec le produit de la PCR a montré un produit de 437pb, caractéristique du groupe Enterovirus. Le sérotype EV-4 a été identifié par IFI. Bien que la DMPB soit une infection virale principalement associée à l’Enterovirus 71 (HEV-71) et au Coxsackievirus A16 (CV-A16), nos résultats soulignent la nécessité d’études épidémiologiques et de laboratoire ciblant l’EV-4 comme agent causal de la DMPB.

INTRODUCTION

La maladie des mains, des pieds et de la bouche (DMPB) est une maladie fréquente chez les nourrissons et les enfants de moins de 10 ans et se caractérise par de la fièvre, des plaies dans la bouche et une éruption cutanée avec des cloques. La MFPB commence par une légère fièvre, un manque d’appétit, un malaise et souvent un mal de gorge. Un ou deux jours après, on observe de la fièvre et le développement de plaies dans la bouche. De petites taches rouges avec des cloques qui deviennent des ulcères apparaissent fréquemment. Elles sont généralement situées sur la langue, les gencives et à l’intérieur des joues. L’éruption cutanée se développe sur 1 à 2 jours avec des taches rouges plates ou en relief, et certaines avec des cloques. L’éruption ne démange pas et se situe généralement sur la paume des mains et la plante des pieds. Elle apparaît également sur les fesses. Bien que, certaines personnes atteintes de la MFM ne présentent que des éruptions cutanées ou des aphtes4.

La transmission se fait de personne à personne par contact direct avec les écoulements du nez et de la gorge ou par voie orale fécale. La fièvre hémorragique n’est pas transmise aux animaux domestiques ou à d’autres animaux, ni par eux. Les cas individuels de HFMD surviennent dans le monde entier, plus fréquemment en été et au début de l’automne4. La propagation verticale de la mère au fœtus se produit également mais, si les cas se résolvent sans complications à long terme, l’infection du premier trimestre peut entraîner un avortement spontané ou un retard de croissance intra-utérin. D’autres complications ont été signalées, notamment une myocardite, une méningo-encéphalite, un œdème pulmonaire et même la mort16.

Le premier rapport sur l’HFMD a été fait par ROBINSON & RHODES en 195812. Ils ont rapporté un exanthème avec fièvre et lésions orales associées, noté chez plus de 60 personnes en juin et juillet 1957 à Toronto, au Canada. Le Coxsackievirus A16 (CV-A16) a été isolé dans deux tiers des 27 échantillons de selles étudiés. L’épidémie suivante de Coxsackievirus rapportée est survenue à Birmingham, en Angleterre, durant l’été 1960 et a été décrite par ALSOP et al.2 qui ont noté des lésions vésiculaires sur les mains et les pieds avec des lésions oropharyngées et qui ont nommé l’éruption hand, foot and mouth disease16.

La MFPB est causée par des entérovirus, membres de la famille des picornavirus (ARN monocaténaire, non enveloppé) et est le plus souvent associée au CV-A16 ou à l’entérovirus 71 (HEV-71). Des cas sporadiques associés aux CV-A4 à CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 à CV-B3 et CV-B5 ont également été signalés. Les infections sont généralement sporadiques mais des épidémies se produisent régulièrement. L’infection virale initiale concerne la muqueuse buccale et la muqueuse iléale et est suivie d’une propagation aux ganglions lymphatiques régionaux dans les 24 heures. La virémie suit rapidement et le virus se propage à la muqueuse buccale et à la peau. Environ le 7e jour après l’infection, les taux d’anticorps sériques peuvent commencer à augmenter 6,8.

PATIENTS ET MÉTHODES

Échantillons : Au cours du mois de juillet 2003, une épidémie de MFM est survenue dans une garderie de la ville de São Paulo, et deux échantillons de selles d’un enfant mâle de 14 mois suspecté d’être un cas ont été envoyés au laboratoire des virus entériques de l’Institut Adolfo Lutz. Il présentait de la fièvre, des plaies dans la bouche, des malaises, un manque d’appétit et une éruption cutanée sur la paume des mains et la plante des pieds. Les huit autres enfants du même centre, âgés de 10 mois à 3 ans, présentaient des symptômes similaires. Le HFMD a été diagnostiqué par d’autres centres médicaux (communication personnelle). Il a été impossible de recueillir des échantillons de sérum appariés pour procéder aux tests sérologiques de titrage des anticorps.

Isolation et identification virale : Les échantillons recueillis dans les six jours du tour, ont été clarifiés sous centrifugation à 10 000 x g/60 minutes, à 4 ºC ; des antibiotiques (streptomycine et pénicilline ) ont été ajoutés et le surnageant a été conservé à -70 ºC jusqu’à l’inoculation (0,1 et 0,2 mL/tube) sur trois lignées cellulaires différentes : RD (rhabdomyosarcome humain), HEp 2 (carcinome épidermique du larynx humain) et Vero (rein de singe vert) contenant un milieu essentiel minimal (Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + piruvate, et milieu 199, respectivement). Ensuite, les tubes ont été conservés à 35-37 ºC. Les cultures ont été observées au microscope inversé tous les jours, afin de visualiser l’effet cytopathique (ECP). Des passages successifs du matériel inoculé ont été effectués jusqu’à l’apparition ou non de l’ECP caractéristique de l’infection par le VHE7.

Dossier d’immunofluorescence indirecte – IFA : Lorsque la culture cellulaire présentait au moins 75% d’ECP, elle était raclée du tube et la suspension cellulaire était déposée sur une lame de verre, qui étaient séchées à l’air et fixées avec de l’acétone. Ensuite, elle a été soumise à un test d’immunofluorescence indirecte (IFA), en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques, disponibles dans le commerce (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) pour le genre, le groupe et les sérotypes du VHE. Les puits des lames ont été examinés sous un microscope à épifluorescence3.

RT-PCR : L’ARN viral a été extrait du virus isolé par Trizol® LS (Invitrogen, cat. 1296-010) et chloroforme, selon les instructions du fabricant. Après centrifugation à 12 000 xg, la phase aqueuse a été séparée et la précipitation effectuée avec de l’alcool isopropylique. Le culot d’ARN a été lavé avec de l’éthanol à 75 %. À la fin de la procédure, l’ARN a été brièvement séché et resuspendu avec de l’eau Milli-Q ; de l’ARNsine a été ajoutée et l’ARN a été stocké à -70 ºC. L’ADNc a été synthétisé en utilisant l’ARN extrait et le mélange : 50 mM MgCl2 ; tampon PCR 10x ; 1,25 nM dNTP ; 20 µM/µL d’amorce AS1/S1 ; 2 µL de transcriptase inverse Super Script II RNAse ; 2,5 U/µL d’ADN polymérase TaqQ ; 40 U/µL d’ARNsine et de l’eau Milli-Q. Les réactions d’amplification ont été réalisées dans le thermocycleur Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer avec la programmation suivante : (42 ºC/1h) + (95 ºC/5 min) + 25 cycles (94 ºC/1 min + 50 ºC/2 min + 72 ºC/1min) + (72 ºC/7min). Les produits de la PCR ont été séparés par un gel d’agarose à 1,5 %, colorés avec du bromure d’éthidium, et visualisés sous lumière UV. Les amorces dirigées vers la région 5’non traduite ont amplifié un produit de 437bp13.

RESULTATS

CPE suggestifs du VHE : arrondissement, rétrécissement, pyknose nucléaire, réfractilité et dégénérescence cellulaire étaient sensibles aux cellules RD et Vero. Le délai de déclaration des cultures positives était d’environ 4 à 7 jours.

Une fluorescence brillante vert pomme dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules a pu être observée au microscope à épifluorescence, à 400x, indiquant une réaction positive à l’échovirus 4 sérotype. L’IFA était négatif pour les autres anticorps monoclonaux.

La RT-PCR a été appliquée pour confirmer le genre HEV. L’électrophorèse sur gel d’agarose a montré un produit de 437 pb, identifiant le VHE (figure 1).

DISCUSSION

L’agent étiologique identifié dans cette étude est le VHE différent de l’autre précédemment lié au HFMD. Ce syndrome a été communément associé au CV-A16 et au VHE-71 alors qu’aucune donnée épidémiologique sur le VHE-4 associé à la MFM, n’a été trouvée dans la littérature.

En attendant, l’épidémie de HFMD survenue en Malaisie (1997) a été associée à EV-1, CV-A9 et HEV-711. La MFM causée par le VHE-71 a été associée à des cas mortels d’encéphalite lors des épidémies survenues en Malaisie (1997) et à Taiwan (1998)17. Au cours de la dernière partie de l’année 2000, on a découvert que l’EV-7, en plus du CV-A16 et de l’EV-7, était un agent étiologique de la MFM5. Au Brésil, MOREIRA et al. (1995) ont relaté une maladie exanthématique épidémique associée au coxsackievirus B3 (CV-B3)10. Aucun rapport sur l’association avec l’EV-4 et le HFMD n’est relaté au Brésil, peut-être en raison de l’absence de suspicions cliniques.

L’EV-4 est généralement lié à la méningite aseptique, l’encéphalite, la paralysie, le syndrome de Güillan-Barré, l’exanthème et les maladies respiratoires et a été trouvé dans le monde entier, principalement comme la cause des épidémies de méningite aseptique : à Cuba, de 1972 à 1999 ; au Cap, en Afrique du Sud, de 1981 à 1989 ; en avril 1997 dans des régions d’Israël et de l’Autorité palestinienne ; en Espagne, de 1988 à 2003 ; à l’automne 1982 en Pologne, et à Vellore et dans les régions avoisinantes en Inde en 20028,9,11,14,15,18.

Typiquement, les infections à entérovirus sont asymptomatiques ou entraînent une maladie légère. Il est donc recommandé de collecter des échantillons de sérum pour procéder au titrage des anticorps par la technique de microneutralisation, ce qui constituerait un paramètre supplémentaire pour confirmer que le virus isolé est bien responsable de la maladie. Associée à l’isolement des selles, la multiplication par quatre du titrage sérique (séroconversion) confirme l’infection aiguë. Malheureusement, il n’a pas été possible d’obtenir des échantillons de sérum dans cette étude.

Malgré cela, les huit autres enfants ont été diagnostiqués comme HFMD par les centres médicaux, sur la base des signes cliniques.

Bien que ce résultat pourrait ne pas être suffisant pour affirmer que l’EV-4 était une cause de la maladie, il semblait raisonnable de conclure que les signaux et les manifestations cliniques évidentes confirment l’hypothèse que le virus n’est pas un virus de passage.

Il est important d’accentuer que CV-A16 et HEV-71, connus comme la principale cause de HFMD, produisent habituellement des ECP dans les cultures de cellules RD, HEp2 et Vero ; mais dans cette étude, ils n’ont pas été identifiés.

Notre travail montre que le VHE-4 est un agent causal de la MFM et suggère la possibilité que d’autres sérotypes de VHE, pourraient éventuellement être liés aux cas de MFM. Ce rapport de cas souligne la nécessité d’intensifier les études épidémiologiques et de laboratoire sur ce sérotype et la surveillance des autres sérotypes de VHE impliqués dans la MFM, doit être accrue au Brésil.

ACKNOWLEDGEMENTS

Nous sommes spécialement reconnaissants au Dr Luís Florêncio Salles Gomes pour ses suggestions et critiques sur cet article.

1. ABUBAKAR, S. ; CHEE, H.Y. ; SHAFEE, N. ; CHUA, K.B. & LAM, S.K. – Détection moléculaire des entérovirus à partir d’une épidémie de maladie des mains, des pieds et de la bouche en Malaisie en 1997. Scand. J. infect. Dis., 31 : 331-335, 1999.

2. ALSOP, J. ; FLEWETT, T.H. & FOSTER, J.R. – « Hand-foot-and-mouth disease » à Birmingham en 1959. Brit. med. J., 5214 : 1708-1711, 1960.

3. BASTIS, D. ; SIMONET, S. ; PATTERSON, M.A. & NEILL, S. – Identifications d’entérovirus par immunofluorescence indirecte utilisant des anticorps monoclonaux. Clin. diagn. Virol. 3 : 38-93, 1995.

4. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION – Respiratory and Enteric Viruses Branch, 2004. (disponible dans http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/Enterovirus/hfhf.htm). Consulté en mai 2005.

5. CHUA, B.H. ; McMINN, P.C. ; LAM, S.K. & CHUA, K.B. – La comparaison des séquences nucléotidiques complètes de la souche UMMC de l’échovirus 7 et de la souche prototype (Wallace) démontre une dérive génétique importante au fil du temps. J. gen. Virol. 82 : 2629-2639, 2001.

6. GRAHAM, B. – Maladie de la main, du pied et de la bouche. Journal EMedicine, 2002. (disponible dans http://www.emedicine.com/derm/topic175htm). Consulté en mai 2005.

7. GRANDIEN, M. ; FORSGREN, M. & EHRNST, A. – Entérovirus et réovirus. dans : LENNETTE, E.H. & SCHMIDT, N.J., ed. Procédures de diagnostic des maladies virales et des rickettsies. 6. ed. Washington, American Public Health Association, 1989. p. 513-578.

8. HANDSHER, R. ; SHULMAN, L.M. ; ABRAMOVITZ, B. et al. – Un nouveau variant de l’échovirus 4 associé à une grande épidémie de méningite aseptique. J. clin. Virol. 13 : 29-36, 1999.

9. McINTYRE J.P. & KEEN, G.A. – Surveillance en laboratoire de la méningite virale par examen du liquide céphalorachidien au Cap 1981-9. Epidem. Infect., 111 : 357-371,1993.

10. MOREIRA, R.C. ; CASTRIGNANO, S.B. ; CARMONA, R.C. et al. – Une épidémie de maladie exanthématique associée à une infection par le coxsackievirus B3 dans une garderie. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 37 : 235-238, 1995.

11. PIERZCHALA, K. ; GRUDZINSKA, B. ; BARA, M. & KLOSINSKA, E. – Séquelles tardives de la méningite virale épidémique. Wiad. lek., 42 : 55-158, 1989.

12. ROBINSON, C.R. ; DOANE, F.W. & RHODES, A.J. – Rapport d’une épidémie de maladie fébrile avec lésions pharyngées et exanthème : Toronto, été 1957 ; isolement du virus Coxsackie du groupe A. Canad. med. Ass. J., 79 : 615-621, 1958.

13. ROTBART, H.A. – Amplification enzymatique de l’ARN des entérovirus. J. clin. Microbiol. 28 : 438-442,1990.

14. SARMIENTO, L. ; MAS, P. ; GOYENECHEA, A. et al. – Première épidémie de méningite à échovirus 16 à Cuba. Emerg. infect. Dis. 7 : 887-889, 2001.

15. SATHISH, N. ; SCOTT, J.X. ; SHAJI, R.V. et al. – Une épidémie de méningite à échovirus chez les enfants. Indian Pediat., 41 : 384-388, 2004.

16. SCOTT, L.A. & STONE, M.S. – Exanthèmes viraux. Derm. J. en ligne, 9 : 4, 2003.

17. SHIMIZU, H. ; UTAMA, A. ; YOSHII, K. et al. – Enterovirus 71 provenant de cas mortels et non mortels d’épidémies de la maladie des mains, des pieds et de la bouche en Malaisie, au Japon et à Taïwan en 1997-1998. Jap. J. infect. Dis., 52 : 12-15, 1999.

18. TRALLERO, G. & AVELLÓN, A. – Importancia del diagnostico de los Echovirus desde el punto de vista epidemiológico. Circulación de Echovirus 11 en los últimos años en España – Control Calidad SEIMC, 2004. (disponible en http://seimc.org/control/revi_viro/echo11.htm). Consulté en mai 2005

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