Diapédèse neutrophile : Paracellulaire ou transcellulaire ?

L’une des caractéristiques classiques de l’inflammation est l’infiltration du tissu affecté par les leucocytes polymorphonucléaires (PMN). Pour que cela se produise, les PMN circulants doivent subir des interactions adhésives avec l’endothélium qui leur permettent d’être activés, de s’aplatir et d’émigrer à travers la paroi endothéliale des microvaisseaux. Les déterminants moléculaires de ces interactions adhésives ont fait l’objet d’études approfondies et il existe un consensus général sur la séquence des événements qui conduisent à la mise en place des PMN en position d’émigrer dans les tissus (3, 12). Initialement, une faible interaction adhésive se produit entre les PMN circulants et l’endothélium, ce qui entraîne un mouvement saltatoire des PMN le long de l’endothélium, un phénomène appelé roulement. Le roulement permet aux PMN de rester en contact étroit avec l’endothélium et, si des médiateurs inflammatoires générés localement sont présents, les PMN sont activés. Une fois activés, les PMN forment des interactions adhésives plus fortes avec l’endothélium qui conduisent à leur arrêt. Par la suite, les PMN émigrent à travers l’endothélium. Contrairement aux interactions adhésives initiales (roulement et adhésion), pour lesquelles il existe un consensus général sur les mécanismes impliqués, on sait peu de choses sur les mécanismes impliqués dans la migration transendothéliale des PMN. Même le principe de base, à savoir si les PMN émigrent entre les cellules endothéliales (voie paracellulaire) ou à travers les cellules endothéliales proprement dites (voie transcellulaire), est controversé.

Le consensus dominant veut que les PMN circulants émigrent du compartiment intravasculaire vers l’interstitium en passant entre les cellules endothéliales adjacentes, c’est-à-dire en utilisant une voie paracellulaire (11). Des études in vivo et in vitro utilisant la microscopie électronique et la microscopie optique ont capturé des PMN en migration qui étendent des pseudopodes entre les cellules endothéliales pour traverser la barrière endothéliale en réponse à un gradient chimiotactique. Pour que les PMN puissent utiliser la voie paracellulaire pour la migration transendothéliale, le couplage adhésif entre les cellules endothéliales adjacentes doit être perturbé et les cellules endothéliales doivent se séparer suffisamment les unes des autres pour permettre le passage des PMN. De nombreux médiateurs inflammatoires utilisés pour simuler une inflammation in vitro peuvent, en soi, induire la formation d’espaces dans les monocouches de cellules endothéliales en culture, c’est-à-dire la rétraction des cellules endothéliales. Cependant, étant donné que de grands espaces entre les cellules endothéliales sont rarement observés dans les modèles d’inflammation in vivo, ce phénomène peut représenter un effet exagéré des médiateurs inflammatoires dans les systèmes in vitro. Les monocouches endothéliales cultivées ont des jonctions d’adhésion interendothéliales sous-développées par rapport à leurs homologues in vivo, et donc les médiateurs inflammatoires peuvent plus facilement produire une rétraction des cellules endothéliales in vitro qu’in vivo (12). Le corrélat in vivo de ce phénomène est l’augmentation de la fuite de macromolécules à travers les jonctions interendothéliales observée en réponse aux médiateurs inflammatoires. Ensemble, les études in vitro accréditent l’idée que les cellules endothéliales peuvent se séparer les unes des autres en réponse aux médiateurs inflammatoires, bien que l’étendue de la séparation puisse être exagérée.

Les preuves que les PMN peuvent induire la rétraction des cellules endothéliales proviennent principalement d’études in vitro qui ont abordé les mécanismes impliqués dans la blessure des cellules endothéliales médiée par les PMN (12). Cette lésion était de nature non lytique et se manifestait par le détachement des cellules endothéliales de monocouches cultivées sur des surfaces non poreuses. Ce détachement des cellules endothéliales s’est produit 3 à 6 heures après la superposition de PMN activées à la surface des monocouches de cellules endothéliales et a été attribué à l’élastase dérivée des PMN. Le détachement des cellules endothéliales étant rarement observé dans les modèles d’inflammation in vivo, le détachement des cellules endothéliales médié par les PMN semble également être une exagération d’un événement in vivo dû aux conditions expérimentales imposées in vitro. Dans ces systèmes (monocouches endothéliales cultivées sur des surfaces non poreuses), les PMN ne peuvent pas migrer et s’éloigner de la monocouche de cellules endothéliales. Ils restent donc à proximité des cellules endothéliales et continuent à aggraver la protéolyse de la monocouche, provoquant finalement la rétraction des cellules endothéliales et leur détachement. Si on laisse les PMN activées migrer à travers les monocouches de cellules endothéliales, on observe rarement une rétraction et un détachement grossiers des cellules endothéliales.

L’élastase dérivée des PMN peut induire une rétraction et un détachement des cellules endothéliales au sein des monocouches. Ce phénomène est analogue à l’utilisation de protéases pour étendre les cellules endothéliales, c’est-à-dire que les cellules traitées par les protéases se rétractent et se détachent du substrat, mais après traitement par des inhibiteurs de protéases, elles peuvent être réensemencées et continuer à se développer normalement. Il est intéressant de noter que la rétraction des cellules endothéliales et la migration transendothéliale des PMN peuvent être empêchées par les inhibiteurs de protéase (par exemple, l’élastase). Ces dernières observations indiquent que les PMN utilisent l’élastase endogène pour induire une rétraction des cellules endothéliales d’une ampleur suffisante pour leur permettre de passer entre les cellules endothéliales adjacentes sans les endommager. Des études récentes suggèrent que la migration transendothéliale des PMN médiée par l’élastase est un processus hautement régulé qui ne nécessite pas de dégranulation des PMN (3). Les PMN activés ne sécrètent pas d’élastase dans le milieu extracellulaire ; ils mobilisent plutôt l’élastase vers la membrane et la localisent sur le front de migration, par exemple les pseudopodes qui pénètrent entre les cellules endothéliales adjacentes. Le fait que la dégranulation des PMN ne soit pas nécessaire à leur migration transendothéliale est confirmé par l’observation que les cytoplastes des PMN (PMN anucléaires dépourvus de granules) migrent à travers les monocouches endothéliales en réponse à un gradient chimiotactique tout aussi efficacement que les PMN normales. Là encore, la migration transendothéliale des cytoplastes peut être empêchée par les inhibiteurs de l’élastase.

Les cellules endothéliales sont maintenues ensemble par des jonctions d’adhésion composées de protéines transmembranaires (11). Ainsi, pour que les neutrophiles passent entre les cellules endothéliales, les interactions adhésives de ces jonctions doivent être perturbées. Il existe deux jonctions d’adhésion pertinentes pour la migration transendothéliale des PMN : les jonctions d’adhérence et les jonctions serrées. Les jonctions d’adhérence sont constituées de complexes vasculaires-endothéliaux (VE)-cadhérine/caténine. La VE-cadhérine possède un domaine extracellulaire qui interagit de manière homotypique avec la VE-cadhérine des cellules endothéliales adjacentes. Le domaine cytoplasmique de la VE-cadhérine s’associe aux β- ou γ-caténines intracellulaires. Ces complexes VE-cadhérine/caténine sont connectés au cytosquelette d’actine via l’α-caténine (Fig. 1A). Les jonctions serrées sont constituées de multiples protéines transmembranaires, dont l’occludine et les claudines 1 et 2, et de protéines intracellulaires associées, comme ZO-1, -2 et -3, qui relient les protéines de jonction serrée au cytosquelette. De ces deux jonctions d’adhésion, l’effet de la migration transendothéliale des PMN sur les jonctions d’adhérence a reçu le plus d’attention.

Des études récentes utilisant la microscopie confocale indiquent que les interactions adhésives des PMN (adhésion et migration transendothéliale) peuvent entraîner une perturbation locale des protéines de la jonction d’adhérence (10). Deux populations de PMN ont été capturées en train d’adhérer à des monocouches de cellules endothéliales : 1) celles sous lesquelles il n’y avait pas de perturbation de la continuité des protéines de la jonction d’adhérence et 2) celles sous lesquelles il y avait une perturbation des protéines de la jonction d’adhérence. La rupture de la continuité des jonctions d’adhérence par les PMN adhérentes était un phénomène local, puisque les jonctions d’adhérence plus éloignées des PMN n’étaient pas affectées. Une analyse systématique a révélé que les protéines de la jonction d’adhérence sous les PMN adhérentes étaient affectées de manière séquentielle, c’est-à-dire que la β-caténine était perdue avant la VE-cadhérine. Les PMN capturées au cours du processus de migration transendothéliale étaient invariablement associées à la perte de toutes les protéines de jonction d’adhérence au site de migration. Là encore, il n’y a pas eu d’effet sur l’intégrité de la jonction d’adhérence à des sites plus éloignés des PMN en migration. En outre, les preuves de l’importance de la perturbation de la jonction d’adhérence dans la migration transendothéliale des PMN sont les suivantes : 1) in vivo, les anticorps contre la VE-cadhérine augmentent l’émigration des PMN, et 2) in vitro, les anticorps contre la VE-cadhérine augmentent la migration transendothéliale des PMN et induisent une réorganisation du cytosquelette d’actine endothélial, entraînant la formation d’espaces entre les cellules endothéliales.

En ce qui concerne les complexes de jonction serrée, des études récentes ont fait des observations similaires. La migration transendothéliale des PMN a perturbé la continuité de ZO-1 et -2 uniquement au niveau du site de pénétration des PMN dans les jonctions interendothéliales (1). Des discontinuités généralisées des jonctions serrées n’ont pas été notées.

Mécanismes potentiels impliqués dans la diapédèse paracellulaire

Le mécanisme par lequel les interactions adhésives PMN-cellules endothéliales perturbent la jonction d’adhérence n’est pas clair. Une possibilité est que les PMN adhérentes utilisent des protéases endogènes pour dégrader les protéines de la jonction d’adhérence (Fig. 1A). Par exemple, les inhibiteurs d’élastase ont été capables de diminuer l’étendue de la perte induite par les PMN des protéines de la jonction d’adhérence VE-cadhérine et β-caténine (2). D’autres études (11) indiquent que les PMN activés peuvent dégrader la VE-cadhérine et qu’un inhibiteur d’élastase peut empêcher cette dégradation. De plus, l’élastase neutrophile purifiée produit des produits de dégradation de la VE-cadhérine similaires à ceux observés après la dégradation de ce composant de la jonction d’adhérence par les PMN activés. Ensemble, il semble probable que l’élastase dérivée des PMN joue un rôle dans la rupture de la jonction d’adhérence.

Les interactions adhésives PMN-cellules endothéliales pourraient également signaler aux cellules endothéliales de participer activement à la migration transendothéliale des PMN en se séparant les unes des autres, c’est-à-dire par la formation d’une fente interendothéliale (Fig. 1A). Cette affirmation est étayée par les éléments de preuve suivants. Les PMN adhérentes peuvent induire une augmentation des niveaux de Ca2+ des cellules endothéliales, et la chélation de ce Ca2+ entraîne une inhibition de la migration transendothéliale des PMN. De plus, l’inhibition de la kinase de la chaîne légère de la myosine endothéliale (un déterminant clé de la formation de la fente des cellules interendothéliales) réduit la migration transendothéliale des PMN (11). Enfin, comme indiqué ci-dessus, les PMN adhérentes affectent la β-caténine intracellulaire avant la VE-cadhérine qui traverse la membrane plasmique. Ensemble, ces observations indiquent que les cellules endothéliales peuvent être amenées à participer activement à la migration transendothéliale des PMN en se rétractant les unes des autres.

Preuves en faveur de la diapédèse transcellulaire

De nombreux rapports anciens et plus récents qui ont examiné la diapédèse des leucocytes in vivo en utilisant une approche ultrastructurale indiquent que la majorité des PMN sortent de la vascularisation de manière transcellulaire, c’est-à-dire, par des pores ou des passages qui traversent le cytoplasme endothélial. L’examen de coupes sériées par microscopie électronique à transmission suggère que les PMN peuvent migrer à travers des régions qui ne sont pas associées à des jonctions cellule-cellule identifiables (4, 5, 8). Il a été avancé que même les coupes sériées ne fournissent pas une preuve sans équivoque qu’une jonction cellulaire n’était pas proche, mais plutôt qu’elle a pu être manquée. En outre, il peut être difficile d’identifier les jonctions d’adhérence denses en électrons, notamment dans les régions où l’endothélium a une hauteur <0,5 μm. Enfin, des données récentes in vitro indiquent que les jonctions d’adhérence cellule-cellule se désassemblent moléculairement pendant la diapédèse des PMN (10), et on ne s’attendrait donc pas à les voir morphologiquement.

Les images de microscopie électronique à balayage fournissent des preuves plus convaincantes que les PMN pénètrent dans les cellules endothéliales par des ouvertures qui ne sont pas associées à des contacts cellule-cellule endothéliale (4, 9). Les PMN qui sont en cours de diapédèse semblent avoir une forme d’haltère, avec une constriction dans la région au niveau de l’endothélium (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). En fonction de la progression de la diapédèse, on observe une extension en forme de bulle qui fait saillie dans la lumière du vaisseau ou qui s’étend dans l’interstitium (5, 9, 11, 15). Cela indique que les leucocytes se pressent à travers un pore circulaire d’un petit diamètre limité plutôt que d’induire la rétraction des cellules endothéliales individuelles les unes par rapport aux autres. La cellule endothéliale et le leucocyte restent en contact étroit tout au long de la diapédèse. L’endothélium semble souvent s’étendre le long du côté luminal de la surface du PMN pour l’engloutir complètement, fermant ainsi l’espace luminal avant que le PMN ne soit libéré dans la matrice tissulaire (4, 5, 8). Ce processus a été fréquemment observé lors de l’émigration in vivo mais il n’a pas été démontré qu’il se produisait lors de la migration transendothéliale in vitro.

Mécanismes potentiels impliqués dans la diapédèse transcellulaire

Bien qu’il soit difficile d’appliquer des approches mécanistes rigoureuses dans les études in vivo, il existe suffisamment de preuves circonstancielles pour soutenir plusieurs mécanismes possibles par lesquels les PMN émigrent de manière transcellulaire. Il est concevable que les pores transcellulaires à travers lesquels les PMN migrent soient le résultat de dommages protéolytiques de l’endothélium. Cependant, il a été souligné que, au moins au niveau ultrastructurel, l’endothélium n’est pas endommagé et continue à former des cavéoles et des vésicules endocytotiques même dans les régions membranaires qui sont en contact étroit avec les PMN (13). Il est plus probable que les PMN, qui semblent migrer sur de courtes distances le long de la surface endothéliale apicale, recherchent des régions fines de l’endothélium, comme les fenestrons. Les fenestrons peuvent être ouverts (50 nm de diamètre) ou sous-tendus par un diaphragme de l’épaisseur de deux membranes plasmatiques (dépourvues de cytoplasme). Ainsi, les PMN peuvent facilement passer à travers les fenestrons ouverts ou passer de manière protéolytique à travers les fenestrons diaphragmés sans endommager l’endothélium proprement dit. Les fenestrons peuvent représenter une voie importante d’émigration des PMN dans les organes qui contiennent des microvaisseaux fenêtrés (par exemple, la muqueuse gastro-intestinale, les glandes sécrétrices).

Dans les organes contenant des microvaisseaux continus (par exemple, la peau, les muscles), les PMN peuvent utiliser des cavéoles ou des vésicules pinocytotiques et y insérer des filopodes pour pénétrer la barrière endothéliale. Ces structures, d’un diamètre compris entre 50 et 100 nm, sont censées médier le transport des protéines à travers l’endothélium et fournir une voie extrajonctionnelle pour la fuite des protéines vasculaires pendant l’inflammation. Récemment, il a été démontré que les cavéoles forment des organites vésiculo-vacuolaires, qui peuvent former de petits passages continus liés à la membrane à travers le cytoplasme d’une cellule endothéliale (6). Il a été démontré que la formation de ces cavéoles et vésicules se poursuit dans les régions de la membrane de la surface endothéliale qui sont en contact avec les PMN adhérentes (13). En outre, les PMN qui adhèrent étroitement à la surface des cellules endothéliales étendent souvent des filopodes en forme de doigts dans des indentations de la membrane plasmique apicale, remodelant ainsi la surface endothéliale (4, 7, 8). La force de projection d’un filopode adhérent dans les organelles vésiculo-vacuolaires en formation peut conduire à l’émergence de ce filopode du côté endothélial abluminal (Fig. 1B), où il peut facilement interagir avec la matrice extracellulaire et s’étendre le long de celle-ci (Fig. 1B).

Une concentration de F-actine et de microfilaments dans les pseudopodes de tête des PMN a été démontrée pendant la diapédèse in vivo (15) et in vitro (3) et peut générer la force nécessaire pour tirer les processus cellulaires en progression à travers les pores transcellulaires. Les pores peuvent s’élargir jusqu’à une taille de 3-5 μm, à travers laquelle le leucocyte peut facilement traverser. Cet élargissement du pore vacuolaire initial peut être accompli en partie par les forces générées par la tension dans le système de microfilament cortical présent dans la partie sphérique du leucocyte qui fait encore saillie dans la lumière du vaisseau. En fait, une concentration de F-actine dans la région caudale des PMN transmigrant a été observée pendant les étapes tardives de la diapédèse (15). En outre, le réarrangement du cytosquelette dans le cytoplasme endothélial peut favoriser l’élargissement du pore transendothélial, comme cela a été suggéré précédemment (14). Le processus de formation du pore serait accompagné d’un étalement des régions apicales de la membrane endothéliale le long de la surface des cellules PMN, conduisant à l’engloutissement éventuel des portions luminales des PMN par l’endothélium, comme l’ont montré les micrographies électroniques (Fig 1B). Cette participation active de l’endothélium aiderait à la rescellation rapide du revêtement endothélial, limitant ainsi la fuite de protéines.

Sommaire

D’après cette revue des preuves, il est évident que les PMN peuvent utiliser des voies paracellulaires et transcellulaires pour traverser la barrière endothéliale pendant l’inflammation. Il convient de souligner que la migration transendothéliale des PMN in vitro favorise la voie paracellulaire, alors que la migration transendothéliale des PMN in vivo favorise la voie transcellulaire. Si l’on suppose téléologiquement que le PMN transmigrant choisira le chemin de moindre résistance, alors il peut y avoir une explication à la divergence apparente entre les résultats obtenus en utilisant des approches in vitro et in vivo.

Dans les monocouches de cellules endothéliales cultivées, les régions les plus atténuées se trouvent près des jonctions cellule-cellule, et il n’est donc pas surprenant que ce soit le site privilégié où se produit la diapédèse. De plus, dans les cellules endothéliales en culture, les jonctions intercellulaires sont des structures instables qui sont constamment désassemblées et réassemblées. Une telle région serait facilement accessible par les pseudopodes des leucocytes transmigrants. Il existe également des preuves que, même in vitro, la voie paracellulaire utilisée par les PMN pendant la diapédèse est spécifiquement sélectionnée, c’est-à-dire que la diapédèse se produit préférentiellement aux coins tricellulaires plutôt qu’entre deux cellules endothéliales (1). Les jonctions d’adhérence et les jonctions serrées sont discontinues à ces coins tricellulaires, présentant ainsi le chemin de moindre résistance pour les PMN transmigrant. En revanche, les jonctions interendothéliales sont beaucoup mieux développées in vivo et sont plus résistantes au mouvement des protéines à travers elles. Ainsi, le PMN peut préférentiellement utiliser les pores de la région fine des cellules endothéliales, tels que les fenestrons ou les cavéoles, comme chemin de moindre résistance.

Attribuer le chemin préférentiel (paracellulaire vs transcellulaire) utilisé par le PMN pendant la diapédèse au fait que des approches in vitro ou in vivo aient été utilisées pour étudier ce phénomène est, notamment, une simplification excessive. Il existe de nombreux exemples de déviations de ce paradigme. Par exemple, il existe des preuves indiquant que les PMN peuvent utiliser la voie paracellulaire in vivo et la voie transcellulaire in vitro. En outre, si la voie transcellulaire est la voie préférentielle pour la diapédèse des PMN in vivo, pourquoi l’interférence avec les protéines jonctionnelles modifie-t-elle de façon spectaculaire la diapédèse des PMN in vivo ? Il se pourrait bien que cet argument persiste pendant des années encore, tout comme l’argument concernant la question de savoir si le mouvement des protéines transendothéliales se produit de préférence par la voie paracellulaire ou transcellulaire. On peut imaginer que les arguments concernant la voie de migration transendothéliale des PMN peuvent, en partie, être attribués à la nature de la réponse inflammatoire ou à la nature du lit vasculaire dans lequel elle se produit. Espérons que d’autres études fourniront des informations supplémentaires qui permettront de résoudre cette controverse.