Chromatographie par filtration sur gel

Applications de la chromatographie par filtration sur gel

La chromatographie par filtration sur gel, un type de chromatographie par exclusion de taille, peut être utilisée soit pour fractionner les molécules et les complexes d’un échantillon en fractions ayant une gamme de taille particulière, soit pour éliminer toutes les molécules plus grandes qu’une taille particulière de l’échantillon, soit une combinaison des deux opérations. La chromatographie par filtration sur gel peut être utilisée pour séparer des composés tels que les petites molécules, les protéines, les complexes protéiques, les polysaccharides et les acides nucléiques lorsqu’ils sont en solution aqueuse. Lorsqu’un solvant organique est utilisé comme phase mobile, le procédé est plutôt appelé chromatographie par perméation de gel.

La chromatographie par filtration sur gel peut également être utilisée pour :

• Fractionnement de molécules et de complexes dans une plage de taille prédéterminée
• Analyse et détermination de la taille
• Élimination de grosses protéines et de complexes
• Échange de tampon
• Désalage
• Élimination de petites molécules telles que les nucléotides, les amorces, les colorants, et les contaminants
• Évaluation de la pureté de l’échantillon
• Séparation des radioisotopes liés des radioisotopes non liés

Les milieux de chromatographie par filtration sur gel pour toutes les utilisations ci-dessus sont disponibles sous forme de colonnes à écoulement gravitaire préemballées, de colonnes de centrifugation, de colonnes de chromatographie à basse et moyenne pression et de résines en bouteille.

Mécanisme de chromatographie par filtration sur gel

Dans une colonne de chromatographie par filtration sur gel, la phase stationnaire est composée d’une matrice poreuse, et la phase mobile est le tampon qui circule entre les billes de la matrice. Les billes ont une plage de taille de pores définie, appelée plage de fractionnement. Les molécules et les complexes qui sont trop gros pour entrer dans les pores restent dans la phase mobile et se déplacent dans la colonne avec le flux du tampon. Les molécules et complexes plus petits qui sont capables d’entrer dans les pores entrent dans la phase stationnaire et se déplacent à travers la colonne de filtration sur gel par un chemin plus long à travers les pores des billes.

Toute molécule ou complexe qui est au-dessus de la gamme de fractionnement pour une colonne de chromatographie par filtration sur gel particulière se déplacera à travers la colonne plus rapidement que toute molécule qui peut entrer dans la phase stationnaire. Par conséquent, tout constituant de l’échantillon qui se trouve au-dessus de la plage de fractionnement sera élué en premier (dans le volume vide) avant tout ce qui se trouve dans la plage de fractionnement. La taille minimale qui restera dans la phase mobile et ne pénétrera pas dans la phase stationnaire est connue sous le nom de limite d’exclusion. Bio-Rad propose des milieux et des colonnes de chromatographie par filtration sur gel dont les limites d’exclusion s’étendent sur trois ordres de grandeur, de 100 daltons à 100 000 daltons (100 kDa).

Les molécules et les complexes qui peuvent entrer dans la phase stationnaire seront fractionnés en fonction de leurs tailles. Les molécules les plus petites vont migrer profondément dans les pores et seront davantage retardées que les molécules plus grosses qui ne pénètrent pas aussi facilement dans les pores et sont donc éluées plus rapidement de la colonne. Cette différence dans la migration des pores conduit à un fractionnement des composants par taille, les plus gros s’éluant en premier.

Dans les colonnes de chromatographie par filtration sur gel conçues pour le dessalage, l’échange de tampon et l’élimination de petites molécules telles que les nucléotides, les sels et les petits composés entrent facilement dans les pores, sont retardés et migrent plus lentement à travers la colonne que les protéines ou les acides nucléiques plus gros. Par conséquent, les composants d’intérêt de l’échantillon sont élués avant les sels, les nucléotides, etc. Les kits de nettoyage de l’ADN utilisant ce mécanisme contiennent souvent des colonnes de spin de filtration sur gel.

La résolution, définie ici comme la netteté des frontières entre les fractions de taille, est déterminée par la taille des billes et un certain nombre d’autres facteurs. Une taille de billes plus petite donne généralement une meilleure résolution dans une colonne de chromatographie par filtration sur gel. Les molécules compactes diffusent à travers la phase stationnaire plus rapidement que les molécules linéaires. L’exclusion de taille, la gamme de fractionnement et la vitesse d’élution sont affectées par la composition du tampon, la force ionique et le pH. Pour le fractionnement de mélanges complexes de protéines, les temps d’élution et les limites d’exclusion de taille peuvent devoir être déterminés empiriquement.

Milieux de chromatographie par filtration sur gel

Un critère important pour les milieux de chromatographie par filtration sur gel est que les milieux soient inertes et que rien dans l’échantillon ou tout tampon ne se lie aux milieux. Une autre considération est le type de colonne de filtration sur gel utilisé et si elle est utilisée dans un système de chromatographie sous pression ou dans des colonnes à écoulement par gravité ou à rotation. Si un système de chromatographie sous pression est utilisé, la colonne et le milieu doivent pouvoir tolérer la pression et les débits utilisés.

Les milieux couramment utilisés pour la chromatographie par filtration sur gel sont à base de billes d’agarose ou de polyacrylamide, de dextrose pour les systèmes par gravité ou à basse pression, et de résines polymères pour les systèmes à moyenne pression. Le choix du milieu dépend des propriétés des composants à séparer et d’autres facteurs expérimentaux. Les points suivants sont des considérations générales pour déterminer le choix des milieux de chromatographie par filtration sur gel :

• Gamme de fractionnement
• Limite d’exclusion de taille
• Pression de fonctionnement
• Débit
• Viscosité de l’échantillon
• Gamme de pH
• Autoclavabilité
• Tolérance aux solvants organiques miscibles à l’eau ; certains échantillons peuvent être plus solubles dans un mélange eau-organique
• Tolérance aux détergents, aux agents chaotropes, au formamide, etc.
• Température de fonctionnement

Les types d’échantillons, le choix du milieu et la configuration du système de chromatographie détermineront les paramètres les plus importants pour une application de purification donnée.

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