Électroporation et méthodes de transfection concurrentes

En plus de l’introduction directe de gènes, l’électroporation facilite le transfert direct de plasmides entre les cellules ou les espèces – par exemple, de la bactérie à la levure.

Des expériences approfondies se poursuivent sur l’utilisation de l’électroporation pour délivrer des médicaments et des vaccins directement dans les cellules des organismes vivants. Cet article se concentre sur les applications non médicales.

L’électroporation est le plus souvent utilisée pour transfecter les cellules de manière transitoire, bien que la transfection stable soit également possible. Dans l’industrie biopharmaceutique, la transfection transitoire permet de produire jusqu’à quelques grammes de protéines pour la caractérisation et les études précliniques. Dans cette application, l’électroporation utilisant des plasmides s’est avérée fiable et prévisible. De même, l’électroporation produit des cellules transfectées de manière stable, à condition que l’ADN soit introduit sous forme linéarisée en le traitant d’abord avec une enzyme de restriction.

Une technique parmi tant d’autres

L’électroporation est fermement établie dans l’arsenal des techniques de transfection qui comprend les vecteurs viraux, les méthodes chimiques ou à base de réactifs, et la délivrance mécanique de gènes. Les vecteurs viraux sont la méthode la plus courante pour générer des cellules transfectées de manière stable pour la fabrication de protéines thérapeutiques. Les vecteurs viraux offrent une très grande efficacité de transfection mais sont limités en termes de longueur d’ADN inséré. Les vecteurs viraux sont également confrontés à des problèmes liés à la biosécurité et à la mutagenèse.

D’autres techniques mécaniques telles que la microprécipitation, la micro-injection, les liposomes, le bombardement de particules, la sonoporation, la poration induite par laser et la transfection par billes sont toutes employées expérimentalement. Ces techniques mécaniques ont un point commun. Elles perturbent les membranes cellulaires et permettent ainsi à l’ADN de pénétrer dans la cellule. Certaines approches – le « canon à gènes », par exemple – impliquent la projection de gènes directement à travers la membrane dans le cytoplasme. De là, les gènes peuvent migrer vers le noyau.

En outre, il existe des techniques hybrides qui exploitent les capacités des méthodes de transfection mécanique et chimique. Par exemple, de nombreux articles ont été publiés au cours de la dernière décennie sur la magnétofection, une méthodologie de transfection qui combine la transfection chimique et les méthodes mécaniques. Par exemple, des lipides cationiques peuvent être déployés en combinaison avec des canons à gènes ou des électroporateurs. La plupart des publications sur la magnétofection portent sur l’administration de gènes et de molécules thérapeutiques à des organismes vivants.

L’électroporation présente plusieurs avantages : polyvalence (fonctionne avec n’importe quel type de cellule), efficacité, très faibles besoins en ADN et possibilité de fonctionner dans des organismes vivants. Les inconvénients comprennent les dommages potentiels aux cellules et le transport non spécifique des molécules dans et hors de la cellule.

Mais parmi les approches de transfection chimique, mécanique et virale, l’électroporation seule offre une certitude raisonnable de succès, quelle que soit la cellule ou l’organisme cible.

Par exemple, la transformation chimique et l’électroporation sont deux méthodes principales pour introduire de l’ADN dans Escherichia coli. Pour cette dernière, les bactéries doivent d’abord être rendues « compétentes » en éliminant les sels tampons pour garantir que le courant atteigne les cellules, puis l’impulsion électrique est appliquée à 0°C pour réduire les dommages aux micro-organismes. La transformation chimique implique une suspension dans du CaCl2, qui crée des pores, suivie d’un choc thermique qui fait pénétrer l’ADN dans les cellules.

Une autre approche utilise des lipides cationiques pour faire levier sur les membranes cellulaires. L’électroporation est moins encombrante et plus efficace, elle fonctionne sur des types de cellules plus variés et se prête plus facilement aux méthodes standard que la transfection chimique. Certains chercheurs préfèrent toutefois la transformation chimique, car elle ne nécessite pas l’achat d’un instrument.

Favoriser l’innovation

Bien que décrite pour la première fois en 1965, l’électroporation continue d’ouvrir des voies vers une science innovante en termes d’instrumentation, de protocoles et d’expérience. Au moins une douzaine de groupes universitaires ont développé des dispositifs d’électroporation basés sur des systèmes microélectromécaniques (MEMS). L’un des avantages des dispositifs à microcanaux est qu’ils peuvent être conçus pour ne pas appliquer une tension supérieure à celle qui est suffisante pour obtenir une incorporation raisonnable des macromolécules. Cet avantage présente également un inconvénient. Contrairement aux systèmes d’électroporation commerciaux, les puces ne fonctionnent pas avec toutes les cellules.

Un groupe du département d’ingénierie biomédicale de l’université Louisiana Tech dirigé par Shengnian Wang, docteur en médecine, a découvert que les nanoparticules d’or améliorent les performances des équipements d’électroporation commerciaux.1 Wang pense que les particules, qui sont hautement conductrices, réduisent la conductivité du milieu cellulaire tout en agissant comme des « microélectrodes virtuelles » pour aider à ouvrir les membranes phospholipidiques. Il affirme que les performances sont améliorées (meilleure efficacité de la délivrance de l’ADN) et que la viabilité des cellules est plus élevée en raison des tensions de porosité plus faibles.

Des chercheurs de la Charité Universitätsmedizin Berlin2 ont mis au point une stratégie d’électroporation à impulsions carrées combinées pour la transfection reproductible des cellules. Britta Siegmund, M.D., et ses collègues suspendent les cellules dans un tampon et les soumettent à une impulsion initiale à haute tension suivie d’une impulsion à basse tension de valeur électrique et temporelle différente. Le Dr Siegmund affirme que la viabilité est comparable à celle de l’électroporation standard et que l’efficacité de la transfection peut atteindre 95 %. Elle conclut que la technique peut être « facilement adaptée aux cellules considérées comme difficiles à transfecter ».

En plus du transfert commun d’ADN, la transfection a été employée pour introduire de l’ARN interférent dans divers types de cellules. Cette technique permet l’étude contrôlée, à petite échelle, de l’efficacité du dosage et de la délivrance. Les problèmes de dosage et d’administration ont entravé les applications pratiques de l’interférence ARN en thérapie. Mais au moins une étude s’est demandé si les gènes d’interférence ARN sont plus efficacement incorporés par des réactifs de transfection ou par électroporation dans les cellules primaires.3

Kirsty Jensen, Ph.D., et ses collègues de l’Université d’Édimbourg ont comparé l’efficacité de 11 kits de réactifs de transfection transitoire et de l’électroporation pour l’extinction du gène immunomodulateur de la fièvre méditerranéenne (MEFV) dans les macrophages dérivés de monocytes bovins. Le groupe a testé les méthodologies pour l’absorption des petits ARN interférents, le knockdown du gène cible, la toxicité cellulaire et l’induction de la réponse à l’interféron de type I.

L’électroporation était à peu près aussi efficace pour knocker le MEFV que les réactifs de transfection. Contrairement aux réactifs, l’électroporation n’a pas induit de réponse interféron, mais la viabilité cellulaire était plus faible. Les questions de viabilité et d’efficacité de transfection pour l’électroporation sont généralement prises comme une évaluation à valeur nominale de la technique.

Le Dr Jensen a conclu que « l’utilisation de réactifs de transfection est plus appropriée que l’électroporation pour notre travail d’investigation du rôle des gènes du macrophage hôte dans la réponse à l’infection », mais que « le choix de transfecter ou d’électroporer le petit ARN interférent dans les cellules dépend des expériences individuelles. »

Dans au moins certains cas où les résultats de l’électroporation sont sous-optimaux, les chercheurs ont négligé d’optimiser des conditions autres que la force de l’impulsion électrique. Comme l’ont récemment noté Hu et ses collègues,4 l’efficacité de l’électroporation est influencée par des facteurs non électriques tels que le type de cellule ou de tissu et la formulation de l’ADN.

L’électroporation est devenue une méthode indispensable pour la biologie du développement in vitro et in vivo. Une bonne partie de ce travail se produit dans des cellules uniques, contribuant à un modèle de grand intérêt pour la thérapeutique, le diagnostic, la délivrance de médicaments et la biologie cellulaire. La nanoporation directe de cellules uniques est difficile en raison de l’incertitude inhérente à la viabilité post-poration.

Des chercheurs de l’université Northwestern ont mis au point une technique unicellulaire qui offre une viabilité et une efficacité élevées.5 Leur approche utilise un dispositif cantilever microfabriqué, la sonde nanofountain (NFP). Elle délivre les molécules aux cellules de manière plus douce que la micro-injection ou la nanoporation en vrac. Les chercheurs ont démontré l’électroporation médiée par la NFP de cellules HeLa uniques avec une efficacité de transfection supérieure à 95 %, une viabilité de 92 % et un contrôle qualitatif du dosage.

Les NFP représentent une amélioration par rapport aux anciennes technologies de transfection employant des sondes de microscopie à force atomique. Les techniques basées sur la microscopie à force atomique provoquent souvent la perte d’attachement ou la rupture des cellules. Les PFN infligent moins de dommages aux cellules.