Yleiskäyttöinen hepariiniantidootti, jolla on vähäinen vaikutus fibriini(ogen) ja plasman hyytymiseen

Tausta ja tavoite

Antikoagulantit ovat keskeisessä asemassa tromboembolisten häiriöiden hoidossa. Antikoagulantteja saavien kirurgisten potilaiden verenvuodot ovat suuri huolenaihe. Antidootteja annetaan antikoagulaation torjumiseksi ja normaalin hemostaasin palauttamiseksi. Tähän mennessä protamiinisulfaatti (PS), kationinen polypeptidi, on ainoa kliinisesti hyväksytty vastalääke fraktioimattomalle hepariinille. PS:llä on toksisia sivuvaikutuksia ja rajoituksia. PS:n kyvyttömyys kumota täysin pienimolekyylisiä hepariineja ja fondaparinuxia johtuu sen alhaisesta sitoutumisaffiniteetista näihin lääkkeisiin. PS on kuitenkin vuorovaikutuksessa hyytymisproteiinien, kuten fibrinogeenin, kanssa muodostaen aggregaatteja, jotka aiheuttavat kardiovaskulaarisia haittavaikutuksia. Kehitimme äskettäin synteettisen universaalin hepariinien käänteislääkkeen (UHRA), jolla on korkea sitoutumisaffiniteetti hepariineihin. In vivo -tutkimukset osoittivat, että UHRA kumoaa täysin kaikkien kliinisesti saatavilla olevien parenteraalisten antikoagulanttien aktiivisuuden, eikä se ole myrkyllistä. Tässä tutkimuksessa pyritään osoittamaan UHRA:n myrkyttömyys arvioimalla sen vaikutusta fibrinogeeniin, fibriinihyytymän arkkitehtuuriin, plasman hyytymiseen ja hyytymän lyysiin.

Menetelmät

UHRA:ta kehitettiin sisällyttämällä tertiääriamiinipohjaisia hepariinia sitovia hepariinisitojaryhmiä dendriittiseen hyperhaaroittuneeseen polyglyserolitelineeseen ja peittämällä se metoksipolyeteeniglykoliketjuilla. UHRA:n vaikutuksen ymmärtämiseksi hyytymisjärjestelmään suoritettiin uudelleenkalsifikaatio- ja kudostekijän (TF) käynnistämät turbidimetriset plasman hyytymismääritykset. UHRA:n vuorovaikutusta fibrinogeenin kanssa tutkittiin fibrinogeenin aggregaatiomäärityksellä, fibriinin polymerisaatiomäärityksellä ja spektroskooppisella analyysillä (fluoresenssi ja sirkulaaridikroismi (CD)). UHRA:n vaikutusta fibriinihyytymän arkkitehtuuriin arvioitiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla (SEM).Antikoagulanttien (hepariinien) neutralointia UHRA:lla tutkittiin fluorogeenisellä trombiinin muodostusmäärityksellä (TGA) ihmisen verihiutaleista koostuvassa plasmassa (PRP). UHRA:ta tai eksogeeniselle kudosplasminogeeniaktivaattorille (t-PA) altistettua PS:ää sisältävän TF:n aiheuttaman plasmahyytymän lyysiä tutkittiin turbidometrisellä määrityksellä.

Tulokset ja pohdinta

Plasman hyytymismääritysten tulokset osoittivat, että UHRA ei muuttanut hyytymisparametreja PS:ään verrattuna (TF:n aloittama viiveaika ja maksimaalinen absorptio, kontrolli vs. UHRA 200 mcg/ml, p=0.21 ja 0,16, vastaavasti; viiveaika ja enimmäisabsorbanssi uudelleenkalsifikaatiossa, kontrolli vs. UHRA 200 mcg/ml, p=0,08 ja 0,13, vastaavasti), mikä viittaa siihen, että UHRA:lla ei ole vaikutusta hyytymisjärjestelmään tutkituilla pitoisuuksilla (kuva 1). Toisin kuin protamiini, UHRA ei vaikuttanut fibrinogeenin aggregaatioon ja fibriinin polymerisaatiomääritykseen laajalla pitoisuusalueella 0,05 mg/ml – 1 mg/ml. Yhdessä tryptofaanifluoresenssin vaimennusmittausten (kuva 2) ja fibrinogeenin sekundäärirakenteen mittausten kanssa vahvistaa, että UHRA ei ole vuorovaikutuksessa fibrinogeenin kanssa. Tulokset eroavat huomattavasti PS:stä ja muista synteettisistä kationisista polymeereistä, jotka ovat vuorovaikutuksessa fibrinogeenin kanssa aiheuttaen aggregaatiota ja konformaatiomuutoksia. UHRA:n läsnäollessa (jopa 0,5 mg/ml:n pitoisuudessa) syntyneet fibriinihyytymät osoittivat samanlaista rakennetta ja kuitujen kokoa kuin normaali fibriinihyytymä (kontrolli vs. UHRA 0,5 mg/ml:n hyytymä, p = 0,12) (kuva 3). Toisaalta 0,05 mg/ml PS:n (kliininen annos) läsnä ollessa muodostuneet fibriinihyytymät kasvattivat kuitujen kokoa ja muuttivat hyytymän rakennetta dramaattisesti (kontrolli vs. PS 0,05 mg/ml hyytymä, p< 0,0001). Plasman hyytymälysointitutkimuksemme eksogeenisen t-PA:n läsnä ollessa osoittavat, että UHRA ei tehostanut hyytymän hajoamista toisin kuin protamiini. UHRA palautti trombiinitasot antikoaguloidussa PRP:ssä (heparinoitu), mikä osoittaa tehon.

Johtopäätökset ja merkitys

Tutkimuksemme osoittavat, että universaalilla hepariiniantidootilla, UHRA:lla, on vähäpätöinen vaikutus fibrinogeeniin, fibriinipolymerisaatioon, hyytymärakenteeseen, hyytymän hajoamiseen ja hyytymisjärjestelmään, mikä paljastaa niiden erinomaisen hemokompatibiliteetin protamiiniin verrattuna. Tuloksemme tukevat sitä, että UHRA voisi olla ihanteellinen vastalääke hemostaasin palauttamiseksi invasiivisten kirurgisten toimenpiteiden jälkeen ja hepariinipohjaisten antikoagulanttien aiheuttamien verenvuotokomplikaatioiden korjaamiseksi.