Uuden botulinum-neurotoksiinin tunnistaminen ja karakterisointi

Genomitietokantojen haku paljasti uuden BoNT-geenin

Yritimme kartoittaa BoNT-geenien evolutiivista maastoa tekemällä iteratiivisia Hidden Markov -malliin perustuvia hakuja Uniprotin sekvenssitietokannasta. Hakumme tunnisti kaikki tunnetut BoNT-alatyypit ja mosaiikkitoksiinit sekä niihin liittyvän jäykkäkouristusneurotoksiinin (Kuva 1a; Täydentävä kuva 1). Yllätykseksemme haku paljasti potentiaalisesti uuden BoNT:n, alustavasti nimetty BoNT/X (kuva 1a, GenBank-numero: BAQ12790.1), C. botulinum-kannan 111 hiljattain raportoidusta genomisekvenssistä. BoNT/X:n proteiinisekvenssi oli vähiten identtinen muiden BoNT:iden kanssa pareittaisissa vertailuissa (kuva 1b). Lisäksi vähäinen sekvenssin samankaltaisuus jakautuu tasaisesti koko BoNT/X-sekvenssissä (kuva 1c), mikä osoittaa, että kyseessä ei ole mosaiikkitoksiini. Tästä alhaisesta sekvenssi-identiteetistä huolimatta BoNT:n yleinen domeenijärjestely on BoNT/X:ssä konservoitunut (kuva 1c), mukaan lukien LC:ssä oleva sinkki-riippuvainen proteaasimotiivi HEXXH (jäännökset 227-231, HELVH) (viite 33) ja HC:ssä oleva SXWY-motiivi (jäännökset 1,274-1,277, SAWY), joka tunnistaa lipidireseptorigangliosideja34.

(a) Kaikkia BoNT:n serotyyppejä, alatyyppejä, mosaiikkimyrkkyjä ja sukulaismyrkkyjä sekä jäykkäkouristukseen liittyvää jäykkäkouristusneurotoksiinia (TeNT) kattava filogeneettinen jaotteluverkko havainnollistaa niiden proteiinisekvenssien perusteella niiden mahdollisia evolutiivisia suhteita sekä esim. kimerismien synnyttämiä konflikteja. BoNT/X on korostettu punaisella. Suurennettu versio tästä paneelista on esitetty täydentävässä kuvassa 1, johon on merkitty kunkin toksiinigeenin järjestysnumero. (b) BoNT/A-G:n, TeNT:n ja BoNT/X:n proteiinisekvenssikohdistusten fylogeeninen puu, joka on analysoitu ClustalW-menetelmällä. Kunkin toksiinin ja BoNT/X:n väliset sekvenssi-identiteettiprosentit on merkitty. (c) Yläpaneeli: BoNT/X:n kolmen domeenin kaavamainen piirros, jossa on merkitty konservoitu proteaasimotiivi LC:ssä ja gangliosideja sitova motiivi HC:ssä. Alempi paneeli: analyysi liukuvan sekvenssivertailuikkunan avulla osoitti, että BoNT/X:n ja muiden BoNT:ien/TeNT:ien välinen vähäinen samankaltaisuus jakautuu tasaisesti koko BoNT/X-sekvenssin pituudelta. X-akseli edustaa kyselysekvenssin sijaintia 100 aminohapon liukuvan sekvenssivertailuikkunan keskellä. Y-akseli osoittaa identtisyysprosentin kyseisen sekvenssi-ikkunan ja kunkin kohdistetun taustasekvenssin välillä. Kuvaajan yläosassa olevat kaksi palkkia kuvaavat parhaiten vastaavaa sekvenssiä (alempi palkki) ja sitä, onko paras vastaavuus merkittävästi erossa toiseksi parhaasta vastaavuudesta (ylempi palkki). (d) Kaavamainen piirros orf-geeniklusterista, joka isännöi BoNT/X-geeniä (ylempi paneeli), jolla on kaksi erilaista piirrettä verrattuna muihin tunnettuihin orfX-klustereihin (keskimmäinen ja alempi paneeli): (1) BoNT/X-geenin vieressä on ylimääräinen orfX2-proteiini (nimetty orfX2b:ksi); (2) orfX-geenien lukukehys on samansuuntainen kuin BoNT/X-geenin.

Muiden BoNT-geenien tapaan BoNT/X-geeni sijaitsee geeniklusterissa23. Kaikki seitsemän vakiintunutta BoNT:tä ilmentyvät yhdessä toisen 150 kDa:n proteiinin, NTNHA:n (non-toxic non-hemagglutinin protein), kanssa, joka muodostaa pH-riippuvaisen kompleksin BoNT:iden kanssa ja suojaa niitä proteaaseilta ruoansulatuskanavassa35. BoNT/X-geeniä edeltää myös mahdollinen NTNHA-geeni (kuva 1d). BoNT:n ja NTNHA:n lisäksi tyypillinen BoNT-geeniklusteri sisältää geenejä, jotka koodaavat jompaakumpaa kahdesta apuproteiinityypistä: (1) HA-klusteria, joka koodaa kolmea konservoitunutta proteiinia HA17, HA33 ja HA70, jotka muodostavat kompleksin BoNT/NTNHA:n kanssa ja helpottavat toksiinien imeytymistä suolen epiteeliesteen läpi36,37,38; tai (2) OrfX-klusteria, joka koodaa konservoituja OrfX1-, OrfX2-, OrfX3- ja P47-proteiineja, joiden funktio on tuntematon23. BoNT/X-geeni sijaitsee OrfX-geeniklusterissa, kuten myös BoNT/E- ja F-geenit sekä BoNT/A-geenin jäsenet. Mielenkiintoista on, että BoNT/X-klusterilla on kaksi ainutlaatuista piirrettä (kuva 1d): (1) on ylimääräinen OrfX2-geeni, jota ei ole muissa BoNT-klustereissa (nimesimme sen OrfX2b:ksi); (2) OrfX-geenien lukukehys on tavallisesti vastakkainen BoNT/NTNHA-geeneihin nähden, mutta se on samansuuntainen kuin BoNT/X-geenin lukukehys BoNT/X-klusterissa (kuva 1d). Nämä havainnot viittaavat siihen, että BoNT/X on ainutlaatuinen BoNT-perheen haara.

BoNT/X:n LC pilkkoo VAMP2:ta uudessa kohdassa

Kuvaillaksemme BoNT/X:ää keskityimme ensin sen LC:hen (X-LC, jäännökset 1-439) ja tuotimme sen His6-merkittynä proteiinina Escherichia coli -bakteerissa. BoNT/A:n (A-LC) ja BoNT/B:n (B-LC) LC:t tuotettiin ja testattiin rinnakkain kontrolleina. X-LC:n inkubointi rotan aivojen detergenttiuutteilla (BDE) ei vaikuttanut syntaksiini 1:een tai SNAP-25:een, mutta poisti VAMP2:n immunoblot-signaalit (kuva 2a). BoNT:n LC:t ovat sinkistä riippuvaisia proteaaseja33. Odotetusti EDTA esti SNARE-proteiinien pilkkoutumisen X-, A- ja B-LC:ssä (kuva 2a). Lisäksi X-LC:n inkubointi puhdistetun VAMP2:n sytosolisen domeenin (jäännökset 1-93) kanssa muutti VAMP2:n kahdeksi alemman molekyylipainon bändiksi (Kuva. 2b, mikä vahvistaa, että X-LC pilkkoo VAMP2:ta.

(a) X-LC inkuboitiin BDE:n kanssa. Suoritettiin immunoblot-analyysi syntaksiini 1:n, SNAP-25:n ja VAMP2:n osoittamiseksi. Synaptofysiini (Syp) toimi latauskontrollina. A-LC ja B-LC analysoitiin rinnakkain. VAMP2:n pilkkominen B-LC:llä johtaa immunoblot-signaalien häviämiseen, kun taas SNAP-25:n pilkkominen A-LC:llä tuottaa pienemmän fragmentin (merkitty tähdellä). EDTA esti X-, A- ja B-LC:n aktiivisuuden. (b) VAMP2 (1-93) inkuboitiin X-LC:n kanssa. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Coomassie Blue -värjäyksellä. X-LC muutti VAMP2:n (1-93) kahdeksi pienemmäksi fragmentiksi. (c-e) VAMP2 (1-93) inkuboitiin X-LC:n kanssa. Näytteet analysoitiin massaspektrometrisesti (LC-MS/MS) pilkkoutuneiden fragmenttien molekyylipainon määrittämiseksi. HPLC-kolonnista eluoituneet peptidipiikit on esitetty juoksutusajan (RT, X-akseli) suhteen. Kahden pilkkoutumistuotteen massaspektrometriatiedot on merkitty värikoodein ja massa-lataussuhde (m/z) on merkitty. Molekyylipaino saadaan kertomalla m z:llä ja vähentämällä z. Kahden pilkkoutumistuotteen proteiinisekvenssit on värikoodattu ja lueteltu kohdassa c. (f) VAMP-perheen jäsenten välinen sekvenssikohdistus, jossa BoNT/B:n, D:n, D:n, F:n, G:n ja X:n pilkkoutumiskohdat on merkitty punaisella ja kaksi SNARE-motiivia sinisellä sävyllä. (g) HA-merkityt VAMP1, 3, 7 ja 8 sekä Myc-merkityt Sec22b ja Ykt6 ekspressoitiin 293T-soluissa ohimenevällä transfektiolla. Solulysaatit inkuboitiin X-LC:llä ja niille tehtiin immunoblot-analyysi. Aktiini on latauskontrolli. (h) GST-merkitty Ykt6 inkuboitiin X-LC:n kanssa (100 nM). Näytteet analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Coomassie Blue -värjäyksellä. (i) GST-tagged VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) ja VAMP5 (1-70) inkuboitiin X-LC:n (100 nM) kanssa. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Coomassie Blue -värjäyksellä. X-LC pilkkoi sekä VAMP4:n että VAMP5:n. Huomaamme, että VAMP5-proteiinissa on kontaminaatiokaista, joka kulkee lähellä pilkkoutumistuotetta. (j) Kokeet suoritettiin kuten kohdassa a, paitsi että VAMP4 ja Sec22b havaittiin. Synaptotagmiini I (Syt I) on latauskontrolli. X-LC pilkkoi natiivin VAMP4:n BDE:ssä. Kuvassa on yksi kahdesta (b,g,j) tai kolmesta (a,h,i) riippumattomasta kokeesta.

Halkaisukohdan tunnistamiseksi analysoimme VAMP2 (1-93) -proteiinin, joko esi-inkuboimalla X-LC:llä tai ilman sitä, nestekromatografia-tandem-massaspektrometrialla (LC-MS/MS, kuva 2c-e). Yksi dominoiva peptidipiikki ilmestyi X-LC:n kanssa inkuboinnin jälkeen (kuva 2c,e; täydentävä kuva 2). Sen molekyylipaino on 3 081,7, joka sopii ainoastaan VAMP2:n A67-L93-peptidisekvenssiin (Kuva 2c,e). Vastaavasti havaittiin myös toinen fragmentti His6-tagin alusta VAMP2:n jäämään R66 (kuva 2d). Tämän havainnon vahvistamiseksi toistimme määrityksen toisella VAMP2-fragmentilla: glutationi-S-transferaasilla (GST) merkityllä VAMP2:lla (33-86) (täydentävä kuva 3). Inkubointi X-LC:n kanssa tuotti yhden dominoivan peptidipiikin, jonka molekyylipaino oli 2 063,1 ja joka sopii vain VAMP2:n A67-R86:een (täydentävä kuva 3). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että X-LC:llä on VAMP2:ssa yksi ainoa pilkkoutumiskohta R66:n ja A67:n välissä.

R66-A67 on uusi pilkkoutumiskohta VAMP2:ssa, joka eroaa kaikista BoNT:iden vakiintuneista kohdekohdista (kuva 2f). Se on myös ainoa BoNT:n pilkkoutumiskohta, joka sijaitsee aiemmin SNARE-motiivina tunnetulla alueella (kuva 2f, tummennetut alueet)39. VAMP-proteiiniperheeseen kuuluvat VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7 ja 8 sekä niihin liittyvät Sec22b ja Ykt6. R66-A67 on konservoitunut VAMP1:ssä ja 3:ssa, jotka ovat hyvin homologisia VAMP2:n kanssa. X-LC:n spesifisyyden validoimiseksi ekspressoimme HA-merkittyjä VAMP1, 3, 7 ja 8 sekä Myc-merkittyjä Sec22b:tä ja Ykt6:ta HEK293-soluissa transienttisen transfektion avulla. Solulysaatit inkuboitiin X-LC:n kanssa. Sekä VAMP1 että 3 pilkkoutuivat X-LC:llä, kun taas VAMP7, VAMP8 ja Sec22b olivat resistenttejä X-LC:lle (kuva 2g).

BoNT/X pilkkoo VAMP4:n, VAMP5:n ja Ykt6:n

Ykt6 pilkkoontui yllättäen myös X-LC:llä (kuva 2g). Tämä havainto vahvistettiin käyttämällä puhdistettua GST-merkittyä Ykt6-fragmenttia, joka siirtyi pienemmän molekyylipainon kaistalle X-LC:n kanssa inkuboinnin jälkeen (kuva 2h). Pilkkoutumiskohdaksi määritettiin K173-S174 massaspektrometria-analyysillä, joka tehtiin ehjän Ykt6:n ja X-LC:llä pilkotun Ykt6:n välillä (lisäyskuva 4). Tämä kohta on homologinen VAMP2:n BoNT/X:n pilkkoutumiskohdan kanssa (kuva 2f). VAMP-proteiiniperheen proteiineista VAMP4 sisältää tässä kohdassa saman jäännösparin (K87-S88) kuin Ykt6. Havaitsimme, että X-LC pilkkoi sekä puhdistetun VAMP4:n GST-merkityn sytoplasmadomeenin (kuva 2i) että natiivin VAMP4:n BDE:ssä (kuva 2j). Kontrollina Sec22b:tä ei pilkottu X-LC:llä BDE:ssä. Lisäksi myös VAMP5:n GST-merkitty sytoplasminen domeeni pilkkoutui (kuva 2i). Halkaisukohdat määritettiin massaspektrometria-analyysin avulla K87-S88:ksi VAMP4:ssä ja R40-S41:ksi VAMP5:ssä (täydentävä kuva 5). Molemmat paikat ovat homologisia VAMP2:n BoNT/X:n pilkkoutumiskohdan kanssa (kuva 2f), mikä osoittaa, että pilkkoutumiskohdan sijainti on konservoitunut eri VAMP:issa. X-LC:n kyky pilkkoa VAMP4:ää, VAMP5:tä ja Ykt6:ta on erittäin epätavallinen, koska niiden sekvenssit eroavat huomattavasti VAMP1/2/3:sta. BoNT/X on ensimmäinen ja ainoa tunnettu BoNT, joka pystyy pilkkomaan VAMP:eja kanonisten kohteiden VAMP1, 2 ja 3 lisäksi (viite 40).

BoNT/X:n proteolyyttinen aktivoituminen

Tarkastelimme seuraavaksi LC:n ja HC:n välistä linkkialuetta, joka bakteeri- tai isäntäproteaasien on pilkottava, jotta toksiini muuttuisi ”aktiiviseksi” kaksoisketjuiseksi. Tuotimme rekombinanttisen X-LC-HN-fragmentin (jäännökset 1-891) E. coli -bakteerissa ja altistimme sen rajoitetulle proteolyysille endoproteinaasi Lys-C:llä. Näytteet analysoitiin käyttämällä Tandem Mass Tag (TMT) -merkintää ja tandem-massaspektrometriaa. TMT leimaa vapaat N-päätteet (ja lysiinit). Lys-C:n suorittama rajoitettu proteolyysi tuotti yhden uuden vapaan N-terminaalin, joka kartoitettiin linkkialueen jäämään N439 (kuva 3a; lisätiedot 1), mikä vahvistaa, että linkkialue on herkkä proteaaseille.

(a) Seitsemän vakiintuneen BoNT:n ja BoNT/X:n sekä BoNT/X:n LC:n ja HC:n välisen linkkereiden sekvenssikohdistus. Lys-C:n leikkauskohta tunnistettiin massaspektrometrisellä analyysillä (ks. menetelmä ja lisätiedot 1). (b) Viljellyt rotan kortikaaliset neuronit altistettiin X-LC-HN:lle 12 tunnin ajan. Solulysaatit kerättiin ja tehtiin immunoblot-analyysi syntaksiini 1:n, SNAP-25:n ja VAMP2:n tutkimiseksi. Aktiini on latauskontrolli. Trypsiinillä aktivoidut A-LC-HN ja B-LC-HN analysoitiin rinnakkain. X-LC-HN tunkeutui neuroneihin ja pilkkoi VAMP2:ta. Lys-C:llä aktivoitu X-LC-HN osoitti suurempaa tehoa kuin aktivoimaton X-LC-HN. X-LC-HN oli tehokkaampi kuin B-LC-HN ja A-LC-HN, joista kumpikaan ei pilkkonut substraattejaan. (c) WT- ja mutantti-X-LC-HN aktivoitiin Lys-C:llä ja analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Coomassie Blue -värjäyksellä DTT:n kanssa tai ilman sitä. C461S- ja C467S-mutantit näkyivät yhtenä ∼100 kDa:n kaistana ilman DTT:tä ja erottuivat kahdeksi ∼50 kDa:n kaistaksi DTT:n kanssa. Osa WT X-LC-HN:stä muodosti aggregaatteja, jotka on merkitty tähdellä ja jotka hävisivät DTT:llä. Suurin osa aktivoidusta WT X-LC-HN:stä erottui kahdeksi ∼50 kDa:n kaistaksi ilman DTT:tä. Tämä johtuu disulfidisidosten sekoittumisesta, kuten seuraavassa paneelissa kuvataan. (d) Lys-C-aktivoitua WT X-LC-HN:ää inkuboitiin NEM:n kanssa disulfidisidosten sekoittumisen estämiseksi. Tämän jälkeen näytteet analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Coomassie Blue -värjäyksellä. Suurin osa WT X-LC-HN:stä esiintyy yksittäisenä ∼100 kDa:n kaistana ilman DTT:tä NEM-käsittelyn jälkeen, mikä osoittaa, että natiivilla WT X-LC-HN:llä on ketjujen välinen disulfidisidos. (e) Kaaviopiirrokset disulfidisidoksesta WT:ssä ja BoNT/X:n kolmessa kysteiinimutaatiossa. (f) Kokeet suoritettiin kuten kohdassa b on kuvattu, paitsi että neuronit altistettiin WT- tai X-LC-HN-mutaatioille. C423S-mutaatio poisti X-LC-HN:n aktiivisuuden, kun taas C461- tai C467-mutaatio ei vaikuttanut X-LC-HN:n aktiivisuuteen. Nämä tulokset vahvistivat, että ketjujen välinen disulfidisidos on välttämätön X-LC-HN:n aktiivisuudelle, ja tämä ketjujen välinen disulfidisidos voi muodostua joko C423-C461 tai C423-C467 kautta. Kuvassa on yksi kahdesta (b) tai kolmesta (b,c,f) riippumattomasta kokeesta.

Tarkastelimme tämän jälkeen, lisääkö proteolyyttinen aktivointi BoNT/X:n tehoa. On osoitettu, että BoNT:n LC-HN:n suurten pitoisuuksien inkubointi viljeltyjen neuronien kanssa johtaa LC-HN:n pääsyyn, todennäköisesti epäspesifisen imeytymisen kautta neuroneihin41. Vastaavasti X-LC-HN pääsi viljeltyihin rotan aivokuoren neuroneihin ja pilkkoi VAMP2:ta pitoisuusriippuvaisella tavalla (kuva 3b). Aktivointi Lys-C:llä lisäsi X-LC-HN:n tehoa: 10 nM aktivoitua X-LC-HN:ää pilkkoi samankaltaisia määriä VAMP2:ta kuin 150 nM ehjää X-LC-HN:ää (kuva 3b). Aktivoitu X-LC-HN näyttää olevan tehokkaampi kuin BoNT/A:n (A-LC-HN) ja BoNT/B:n (B-LC-HN) aktivoidut LC-HN:t, jotka eivät osoittaneet havaittavaa substraattiensa pilkkoutumista samoissa määritysolosuhteissa (kuva 3b).

Ketjujen välinen disulfidisidos BoNT/X:ssä

Kuten muissakin BoNT:issä, myös BoNT/X:n linkkialueella on kaksi konservoitunutta kysteiiniä, mutta BoNT/X:ssä on myös yksi ylimääräinen, vain BoNT/X:lle ominainen kysteiini (C461) (kuva 3a). Niiden kysteiinijäämien määrittämiseksi, jotka muodostavat välttämättömän ketjujen välisen disulfidisidoksen, tuotimme kolme X-LC-HN-mutanttia, joissa jokaisessa yksi kolmesta kysteiinijäännöksestä oli mutatoitunut (C423S, C461S ja C467S). Näille mutanteille sekä villityyppiselle (WT) X-LC-HN:lle tehtiin rajoitettu proteolyysi Lys-C:llä, minkä jälkeen ne analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Coomassie Blue -värjäyksellä pelkistävän aineen, ditiotreitolin (DTT), kanssa tai ilman sitä (kuva 3c). LC:n ainoan kysteiinin (C423S) mutaation odotetaan poistavan ketjujen välisen disulfidisidoksen. Johdonmukaisesti C423S-mutantti erottui kahdeksi ∼50 kDa:n kaistaksi ilman DTT:tä. Sitä vastoin sekä C461S- että C467S-mutantit näkyivät yhtenä 100 kDa:n kaistana ilman DTT:tä ja erottuivat kahdeksi ∼50 kDa:n kaistaksi DTT:n läsnä ollessa. Nämä tulokset osoittivat, että LC:n C423 voi muodostaa ketjujen välisen disulfidisidoksen joko HC:n C461:n tai C467:n kanssa. Havaitsimme myös, että Lys-C-käsittely hajotti merkittävän osan C423S-mutantista verrattuna C461S- tai C467S-mutantteihin (kuva 3c, +DTT), mikä viittaa siihen, että ketjujen välisen disulfidisidoksen menettäminen tekee molekyylistä herkemmän proteaaseille. Huomasimme, että osa WT X-LC-HN:stä muodosti aggregaatteja SDS-PAGE-geelin yläosaan (kuva 3c, merkitty tähdellä). Nämä aggregaatit hävisivät DTT:n läsnäollessa. C423/C461/C467 ovat ainoat kolme kysteiiniä X-LC-HN:ssä; minkä tahansa niistä mutaatio poisti aggregaattien muodostumisen (kuva 3c, -DTT), mikä viittaa siihen, että nämä aggregaatit muodostuvat molekyylien välisistä disulfidisidoksista, jotka johtuvat ylimääräisen kysteiinin olemassaolosta linkkialueella.

Mielenkiintoista on, että suurin osa aktivoituneesta WT X-LC-HN:stä erottui kahdeksi ∼50 kDa:n kaistaksi ilman DTT:tä (kuva 3c), mikä on samanlaista kuin C423S-mutantilla. Toisaalta WT X-LC-HN ei osoittanut lisääntynyttä hajoamista Lys-C:llä verrattuna C423S-mutanttiin (Kuva 3c, +DTT). Yksi mahdollinen selitys on, että WT X-LC-HN sisältää ketjujen välisen disulfidisidoksen natiiviolosuhteissa, mutta tämä sidos voi järjestäytyä ketjun sisäiseksi C461-C467-pariksi denaturoivissa olosuhteissa SDS-puskurissa. Tämä ilmiö tunnetaan nimellä disulfidisidoksen sekoittuminen, jota esiintyy usein vierekkäisten kysteiinien välillä. Tämän hypoteesin testaamiseksi käytimme alkyloivaa reagenssia, N-etyylimaleimidiä (NEM), joka pysyvästi estää vapaita kysteiinejä ja estää disulfidisidosten sekoittumisen. Kuten kuvassa 3d on esitetty, NEM:llä esikäsitelty WT X-LC-HN näkyi yhtenä 100 kDa:n kaistana ilman DTT:tä, ja se erottui kahdeksi ∼50 kDa:n kaistaksi DTT:n läsnä ollessa. Nämä tulokset vahvistavat, että WT X-LC-HN sisältää pääasiassa ketjujen välisen disulfidisidoksen, mutta se on altis disulfidisidosten sekoittumiselle linkkialueella olevan ylimääräisen kysteiinin vuoksi (kuva 3e).

Tutkimme edelleen kolmen X-LC-HN:n kysteiinimutantin aktiivisuutta viljellyissä neuroneissa. Odotetusti C423S-mutantti oli inaktiivinen, kun taas C461S- ja C467S-mutantit osoittivat molemmat samanlaista aktiivisuutta kuin WT X-LC-HN (Kuva 3f). Nämä tulokset vahvistavat, että ketjujen välinen disulfidisidos on kriittinen BoNT/X:n aktiivisuuden kannalta.

Täyspitkän BoNT/X:n tuottaminen sortaasivälitteisen ligaation avulla

Tämän jälkeen pyrimme selvittämään, onko täyspitkä BoNT/X toimiva toksiini. Koska BoNT/X:n vasta-aineita ei ole saatavilla, päätimme välttää täyspitkän aktiivisen toksiinigeenin tuottamista. Sen sijaan kehitimme menetelmän, jolla voimme tuottaa rajoitetun määrän täyspitkiä BoNT:tä koeputkissa ligaamalla entsymaattisesti kaksi ei-toksista BoNT:n fragmenttia. Menetelmässä käytetään sortaasiksi kutsuttua transpeptidaasia42,43, joka tunnistaa peptidimotiivin LPXTG, pilkkoo T-G:n välillä ja muodostaa samanaikaisesti uuden peptidisidoksen muiden N-terminaalista glysiiniä sisältävien proteiinien/peptidien kanssa (kuva 4a). Tuotimme kaksi myrkytöntä BoNT/X:n fragmenttia: (1) LC-HN, jossa on LPETGG-motiivi ja His6-tunniste fuusioituneena C-terminaaliin; ja (2) BoNT/X:n HC (X-HC), jossa on GST-tunniste, trombiinin pilkkomiskohta ja ylimääräinen glysiinijäännös sen N-terminaalissa. Trombiinin leikkaaminen vapauttaa X-HC:n, jonka N-terminaalissa on vapaa glysiini. Näiden kahden fragmentin inkubointi sortaasin kanssa tuotti pienen määrän ∼150 kD:n täyspitkää BoNT/X:ää (X-FL, kuva 4a,b). Huomataan, että X-HC:llä oli huono liukoisuus ja voimakas taipumus aggregaatioon, mikä saattaa olla syynä heikkoon ligointitehokkuuteen (kuva 4b). Sitä vastoin X-LC-HN:n ligointi BoNT/A:n HC:n (A-HC) kanssa saavutti paremman tehokkuuden, ja suurin osa X-LC-HN:stä ligoitui XA-kimeeriseksi toksiiniksi (täydentävä kuva 6a). Bioturvallisuuden varmistamiseksi esiastefragmenttien määrä reaktiossa on tiukasti rajoitettu, jotta saadaan aikaan toiminnallisiin määrityksiin tarvittava minimimäärä ligoitua toksiinia.

(a) Kaavio sortaasin ligointimenetelmästä. (b) Sortase-ligaatioreaktioseokset analysoitiin SDS-PAGE:lla ja Coomassie Blue -värjäyksellä. Tähdellä on merkitty proteiinien aggregaatit, jotka johtuvat molekyylien välisistä disulfidisidoksista. Täyspitkä BoNT/X (X-FL) esiintyi vain sortaasiligaation seoksessa. (c) Neuronit altistettiin sortaasiligaatioseokselle (15 μl) tai kontrolliseoksille 12 tunnin ajan elatusaineessa. Solulysaatit analysoitiin immunoblotilla. Sekoitus, joka sisälsi sekä X-LC-HN:ää että X-HC:tä (mutta ei sortaasia), pilkkoi hieman enemmän VAMP2:ta kuin pelkkä X-LC-HN. X-LC-HN:n ja X-HC:n ligaaminen sortaasilla lisäsi VAMP2:n pilkkoutumista entisestään, mikä osoittaa, että ligoitu X-FL on toiminnallinen neuroneissa. (d) BoNT/A-G:lle, BoNT/DC:lle ja BoNT/X:lle tehtiin dot blot -testi, jossa käytettiin neljää hevosvasta-ainetta (kolmiarvoinen anti-BoNT/A, B ja E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC ja anti-BoNT/F) sekä kahta vuohivasta-ainetta (anti-BoNT/G ja anti-BoNT/D). BoNT/X koostuu X-LC-HN:stä ja X-HC:stä moolisuhteessa 1:1. Nämä antiseerumit tunnistivat vastaavat kohdetoksiininsa, mutta yksikään niistä ei tunnistanut BoNT/X:ää. BoNT/DC:n ja BoNT/C:n vasta-aineet reagoivat ristiin, koska näiden kahden toksiinin HC-domeenit ovat hyvin samankaltaisia. (e) Viljellyt rotan kortikaaliset neuronit altistettiin ligatoidulle X-FL:lle elatusaineessa 12 tunnin ajan kahden antiseerumiyhdistelmän kanssa tai ilman niitä. Ab1: kolmenarvoinen anti-BoNT/A/B/E, anti-BoNT/C ja anti-BoNT/F. Ab2: anti-BoNT/G ja anti-BoNT/D. Kolmiarvoista anti-BoNT/A/B/E:tä käytettiin laimennoksena 1:50. Kaikkia muita antiseerumeita käytettiin laimennoksena 1:100. Mikään antiseerumi ei vaikuttanut VAMP2:n ja VAMP4:n pilkkoutumiseen X-FL:n avulla. Näiden antiseerumien spesifisyys ja teho validoitiin niiden kyvyn neutraloida kohdeserotyyppejä samassa määrityksessä, joka on kuvattu lisäkuvassa 7. (f) Sortase-reaktiolla yhdistetty X-FL (0,5 μg) injektoitiin hiirten (n=4) oikean takaraajan gastrocnemius-lihakseen. Ruiskutettuun raajaan kehittyi tyypillinen veltto halvaus, eivätkä varpaat levinneet 12 tunnin kuluessa. Vasemmalle raajalle ei ruiskutettu toksiineja, ja se toimi kontrollina. (g) BoNT/X:n täyspitkä inaktiivinen muoto (BoNT/XRY) puhdistettiin His6-merkityksi rekombinanttiproteiiniksi E. coli -bakteerissa. Puhdistettu BoNT/XRY on esitetty täydentävässä kuvassa 8b. Kuvassa on yksi kahdesta (e) tai kolmesta (c,d) riippumattomasta kokeesta.

Analysoimme ensin ligoidun BoNT/X:n aktiivisuutta käyttäen viljeltyjä rotan kortikaalisia neuroneja. Neuronit altistettiin sortaasin ligointiseokselle ja kontrolliseoksille kasvatusmediassa. Kuten kuvasta 4c käy ilmi, X-LC-HN yksinään pilkkoi jonkin verran VAMP2:ta johtuen sen suuresta pitoisuudesta reaktioseoksessa. X-HC:n sekoittaminen X-LC-HN:n kanssa ilman sortaasia lisäsi hieman VAMP2:n pilkkoutumista verrattuna pelkkään X-LC-HN:ään, mikä viittaa siihen, että X-HC saattaa liittyä X-LC-HN:ään ei-kovalenttien vuorovaikutusten kautta. Tämä vuorovaikutus näyttää olevan spesifinen, sillä A-HC:n sekoittaminen X-LC-HN:n kanssa ei lisännyt VAMP2:n pilkkoutumista neuroneissa (täydentävä kuva 6b). X-LC-HN:n ja X-HC:n ligaaminen sortaasilla lisäsi selvästi VAMP2:n pilkkoutumista verrattuna X-LC-HN:n ja X-HC:n seokseen ilman sortaasia (kuva 4c). Nämä tulokset osoittivat, että X-HC on toimiva solujen kohdentamisessa ja että ligoitunut täyspitkä BoNT/X pääsi neuroneihin ja pilkkoi VAMP2:ta. Vastaavasti myös ligoitu XA tunkeutui neuroneihin ja pilkkoi VAMP2:ta (Täydentävä kuva 6b).

BoNT/X:ää ei tunnistettu tunnettuja BoNT:itä vastaan tehdyillä antiseerumeilla

Suoritimme seuraavaksi pisteblot-testejä käyttäen tunnettuja BoNT:itä vastaan kasvatettuja antiseerumeja, mukaan luettuina kaikki seitsemän serotyyppiä sekä eräs mosaiikkimäinen toksiini (BoNT/DC), vahvistaaksemme BoNT/X:n serologisesti ainutlaatuisen olon. Käytettiin neljää hevosen antiseerumia (kolmiarvoiset anti-BoNT/A, B ja E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC ja anti-BoNT/F) sekä kahta vuohen antiseerumia (anti-BoNT/G ja anti-BoNT/D). Näiden antiseerumien spesifisyys ja teho validoitiin ensin analysoimalla niiden kykyä neutraloida BoNT:tä viljellyissä neuroneissa. Odotetusti kaikki antiseerumit neutraloivat kohteena olevat BoNT:t vaikuttamatta eri serotyypin aktiivisuuteen (lisäkuva 7). Havaitsimme, että nämä antiseerumit tunnistivat vastaavat BoNT:t dot blot -testissä, mutta yksikään niistä ei tunnistanut BoNT/X:ää (kuva 4d).

Analysoimme edelleen, voivatko nämä antiseerumit neutraloida BoNT/X:n myrkyllisyyttä neuroneihin. Sortase-välitteisellä ligaatiolla tuotettu X-FL aktivoitiin ensin rajoitetulla proteolyysillä trypsiinillä. Käytimme trypsiiniä X-FL:n aktivoimiseen Lys-C:n sijasta toiminnallisissa määrityksissä, koska trypsiinin avulla voimme pysäyttää proteolyysin käyttämällä trypsiinin estäjiä. Aktivoitu X-FL tunkeutui viljeltyihin rotan kortikaalisiin neuroneihin ja pilkkoi sekä VAMP2:ta että VAMP4:ää pitoisuusriippuvaisella tavalla (kuva 4e). Tunnettuja BoNT:itä vastaan käytettävien antiseerumien yhdistelmät (Ab1 (hevosvasta-aineet): kolmiarvoiset anti-BoNT/A, B ja E, anti-BoNT/C ja anti-BoNT/F; Ab2 (vuohenvasta-aineet): anti-BoNT/G ja anti-BoNT/D) eivät vaikuttaneet ligatoidun X-FL:n aktiivisuuteen, kuten VAMP2:n ja VAMP4:n pilkkoutumisen samankaltaiset asteet näiden antiseerumien läsnä ollessa osoittivat (kuva 4e). Nämä tulokset vahvistivat, että BoNT/X on uusi BoNT-serotyyppi.

BoNT/X indusoi velttoa halvaantumista in vivo hiirissä

Seuraavaksi pyrimme määrittämään, onko BoNT/X aktiivinen in vivo käyttämällä vakiintunutta, ei-tappavaa koetta hiirissä, joka tunnetaan nimellä Digit Abduction Score (DAS) -koe, jolla mitataan paikallista lihashalvaantumista sen jälkeen, kun hiiren takaraajojen lihaksiin on ruiskutettu BoNT-yhdisteitä44. BoNT:t aiheuttavat raajojen lihasten velttoa halvaantumista, joka ilmenee siten, että varpaita ei pystytä levittämään vasteena säikähdysärsykkeeseen. Ruiskutimme ligoitua X-FL:ää (0,5 μg, aktivoituna trypsiinikäsittelyllä) hiirten oikean takaraajan gastrocnemius-lihaksiin, mikä aiheutti tyypillisen veltostuneen halvauksen ja varpaiden levittämisen epäonnistumisen (kuva 4f), mikä osoittaa, että BoNT/X pystyy aiheuttamaan veltostuneen halvauksen in vivo. Huomaamme, että ligatoidun X-FL:n teho näyttää olevan paljon pienempi kuin muiden BoNT:ien tässä testissä. Vahvistaaksemme edelleen ligatoidun X-FL:n vähäisen toksisuuden ruiskutimme hiirille 1 μg ligatoitua X-FL:ää vatsansisäisesti (n=3). Yhdelläkään hiirellä ei ilmennyt systeemisiä vaikutuksia, ja kaikki selvisivät hengissä tällä annoksella. Näin ollen ligatoidulla X-FL:llä on melko alhainen myrkyllisyys in vivo hiirillä verrattuna muihin natiiveihin BoNT-yhdisteisiin, joiden tappavat annokset ovat yleensä alhaisia pikogramman tasoja hiirtä kohti.

Täysin pitkä inaktiivinen BoNT/X

Viimeiseksi kehitimme BoNT/X:n inaktiivisen mutaation potentiaaliseksi reagenssiksi neutraloivien vasta-aineiden tuottamiseen. BoNT/A:n kahden jäännöksen (R362A/Y365F) mutaatiot inaktivoivat LC:n proteaasiaktiivisuuden ja poistavat BoNT/A:n toksisuuden in vivo45,46. Nämä kaksi jäännöstä ovat konservoituneet BoNT/X:ssä. Lisäsimme vastaavat mutaatiot (R360A/Y363F) BoNT/X:ään ja tuotimme täyspitkän inaktiivisen muodon, jota nimitettiin BoNT/XRY:ksi. Kuten kuvassa 4g on esitetty, BoNT/XRY puhdistettiin His6-merkityksi proteiiniksi E. coli -bakteerissa, eikä sillä ollut aktiivisuutta viljellyissä neuroneissa (lisäyskuva 8a). Lisäksi hiirten vatsansisäinen injektio 30 μg BoNT/XRY:tä (aktivoituna trypsiinikäsittelyllä) ei aiheuttanut mitään haittavaikutuksia (n=5), mikä osoittaa, että se ei ole toksinen in vivo. Huomattava osa BoNT/XRY:stä muodosti aggregaatteja SDS-PAGE-geelin yläosaan (kuva 4g). DTT:n lisääminen vähensi nämä aggregaatit monomeeriseksi BoNT/XRY:ksi (kuva 4g). Täyspitkä BoNT/X on siis altis muodostamaan molekyylien välisiä disulfidisidoksia. BoNT/X:n monomeerinen muoto voidaan kuitenkin puhdistaa ja se on stabiili liuoksessa (kuva 4g). Lisäksi kehitimme skaalautuvan puhdistusprotokollan, joka tuotti BoNT/XRY:tä, jonka saanto oli ∼3 mg litraa viljelmää kohti ja puhtaus ∼90 % (täydentävä kuva 8b). Erittäin puhdistettu BoNT/XRY pysyi stabiilina liuoksessa aina 10 mg:aan ml-1 asti pelkistävän aineen läsnä ollessa. Tämä atoksinen BoNT/XRY on arvokas reagenssi neutraloivien vasta-aineiden tuottamiseen.