Articles /

U.S. Food and Drug Administration

Bacteriological Analytical Manual (BAM) Main Page

Authors: Bennett ja Jennifer M. M. Hait

Revision History:

  • Kesäkuu 2017 – Bacteriological Analytical Manual -käsikirjaan lisättiin uusi luku 13B
  • Tammikuu 2018 – Hyperlinkki CDC:n APHIS/CDC:n lomakkeelle 4 korjattu

Stafylokokin aiheuttama ruokamyrkytys (SFP, engl. stafylococcal food poisoning) on myrkytystauti, joka aiheutuu sellaisen ruoan nauttimisesta, joka on saastunut riittävillä määrillä esiasteutuneita enterotoksiineja. SFP:n oireet ilmenevät 2-8 tunnin kuluessa nauttimisesta, ja niihin kuuluu pahoinvointia, oksentelua, vatsakramppeja ripulin kanssa tai ilman, ja ne häviävät yleensä 24-48 tunnin kuluessa. (Argudin et al., 2010). SFP:hen sairastuneiden ihmisten määrä on vain arvio, koska diagnoosivirheitä ja vähäisiä taudinpurkauksia ei ilmoiteta. Sairaalahoitoon joutuminen on harvinaista, mutta sitä on havaittu immuunipuutteisilla ihmisillä, erityisesti iäkkäillä ja hyvin nuorilla (Scallan ym., 2011).

Stafylokokkeja esiintyy normaalisti ihmisen iholla ja limakalvoilla noin 20-30 %:lla pysyvän ja 60 %:lla ajoittaisen kolonisaation ollessa kyseessä (Kluytmans ym., 2005). Elintarvikkeiden käsittelijöitä, jotka ovat kolonisoituneet enterotoksigeenisten stafylokokkien kanssa, pidetään elintarvikkeiden kontaminaation pääasiallisena lähteenä suorassa kosketuksessa tuotteiden tai kosketuspintojen kanssa. Myös eläimet, kuten lypsykarja, voivat kantaa stafylokokkeja, ja ne voivat olla maidon ja maitotuotteiden kontaminaatiolähde. Lopuksi, ympäristössä esiintyvät stafylokokit voivat siirtyä elintarvikkeisiin, jotka toimivat potentiaalisena kontaminaatiolähteenä (Gutiérrez et al., 2012).

SFP:hen yleisesti yhdistettyihin elintarvikkeisiin kuuluvat jalostetut elintarvikkeet, liha, siipikarja, maitotuotteet ja leipomotuotteet. Kun elintarvike on saastunut, stafylokokit voivat kasvaa ja tuottaa enterotoksiinia, erityisesti jos ei noudateta hyviä valmistusolosuhteita, jotka estävät kasvun, kuten jäähdytettyjä varastointiolosuhteita tai lämpötappovaiheita, kuten pastörointia (Gutiérrez et al., 2012). Stafylokokin enterotoksiinit ovat lämpöstabiileja eivätkä denaturoidu, ellei niitä altisteta korkeille lämpötiloille pitkiä aikoja, ts, autoklavointi 121 °C:ssa 15 PSI:n paineella 60 minuutin ajan (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus yhdistetään tavallisimmin stafylokokkiperäisiin ruokamyrkytysepidemioihin, mutta myös muita enterotoksigeenisiä koagulaasipositiivisia stafylokokkeja, kuten S. hyicusta ja S. intermediusta, on yhdistetty epidemioihin (Hennekinne ym., 2010). Stafylokokin enterotoksiinit (SE) ovat pyrogeenisia eksotoksiineja, joilla on superantigeeninen aktiivisuus. Enterotoksiinit ovat pallomaisia proteiineja, jotka kestävät lämpöä ja proteaaseja ja joiden molekyylikoko on keskimäärin noin 25 kDa. Arviot sairauden aiheuttamiseen tarvittavan toksiinin määrästä ovat hyvin alhaisia. Eräässä suklaamaitoon liittyvässä taudinpurkauksessa SEA:ta havaittiin 0,5 ng/ml (Evenson ym., 1988) ja 0,38 ng/ml SEA:ta havaittiin maitojauheeseen liittyvässä taudinpurkauksessa (Asao ym., 2003).

Klassisilla SE:illä (SEA-SEE) ja ei-klassisilla SE:illä, SEG:llä, SEH:llä, SEI:llä, SER:llä ja SET:llä, on todistetusti oksentelu- ja oksentelu- ja oksentelu-aktiivisuutta. SE:n kaltaisten enterotoksiinien SElJ-SElQ, SElS, SElU ja SElV emeettistä aktiivisuutta ei ole vielä osoitettu. Kaikki se- ja sel-geenit on sijoitettu liikkuviin geneettisiin elementteihin, kuten bakteriofageihin, patogeenisuussaarekkeisiin, plasmideihin tai transposoneihin (Argudin ym., 2012).

SE:iden havaitseminen on ensiarvoisen tärkeää elintarviketurvallisuuden ja elintarvikehuollon suojelun kannalta. SE:n havaitsemismenetelmät perustuvat kaupallisesti saatavilla oleviin polyvalentteihin entsyymisidonnaisiin immunomäärityksiin (ELISA) tai entsyymisidonnaisiin fluoresoiviin immunomäärityksiin (EFLA), joissa on vasta-aineita, jotka havaitsevat SEA-SEE:n. Yksiarvoiset menetelmät ovat spesifisiä SEA-SEE:lle, ja niitä voidaan käyttää näiden tyyppien erottamiseen. Menetelmät edellyttävät enterotoksiinin uuttamista epäillystä elintarvikkeesta ennen analysointia. Menetelmän herkkyys ja selektiivisyys paranevat, kun elintarvikeuute konsentroidaan dialyysillä, mutta aikarajoitukset voivat edellyttää alustavaa testausta ilman konsentrointia. Dialyysikonsentrointi olisi kuitenkin tehtävä kaikille maitotuotteille ennen analyysia (Hennekinne ym., 2012).

VAROITUS: Stafylokokki-enterotoksiinit ovat erittäin myrkyllisiä, ja toimenpiteet, jotka voivat synnyttää aerosoleja, olisi suoritettava hyväksytyssä biologisessa turvakaapissa (BSC). Stafylokokin enterotoksiinit (SEA, SEB, SEC, SED ja SEE) ovat valikoivia aineita. Tutkijoiden on noudatettava CDC:n laatimia ohjeita: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Erityislaitteet ja -materiaalit
    1. Lämpötilavalvottu huone tai jääkaappi 2-8°C.
    2. Sekoitin tai homogenisaattori.
    3. Inkubaattori 35-37°C.
    4. Analyyttinen vaa’anen ja punnitusalustat.
    5. Tarjotin dialyysihauteille.
    6. pH-mittari. Uuttamisen aikainen pH ja uutossa käytettävien puskurien pH ovat tärkeitä. Tee säädöt ± 0,1 pH-yksikön tarkkuudella.
    7. Jäähdytetty sentrifugi 2-8 °C.
    8. Laboratorioastiat lasia tai polypropeenia toksiinien adsorption välttämiseksi.
    9. Suodatinkangasta käytetään roskien keräämiseen sentrifugoinnin jälkeen. Usein tähän tehtävään käytetään useita kerroksia valmiiksi kostutettua karkeaa juustoliinaa.
    10. Separointisuppilo.
    11. Dialyysimembraani MWCO 6 000-8 000 daltonia (esim. Spectra/Por® sulkimilla) tasoleveys 23 ± 2 mm.
    12. Vakuumikartioputkisuodatuslaitteet (0,22 µm:n kalvo), kuten Steriflip (EMD Millipore), joita suositellaan nestemäisten viljelmien supernatanttien suodattamiseen turvallisuustoimenpiteenä enterotoksiinien aerosolisoitumisen välttämiseksi.
    13. Biologinen turvakaappi.
  2. Reagenssit

    Huomautus: Kittien valmistajat saattavat vaatia erilaisia puskureita tai liuottimia.

    1. Fosfaattipuskuroitu keittosuolaliuos (PBS-liuos) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) 1L PBS:n valmistamiseksi liuotetaan 9 g NaCl ja 3,58 g Na2HPO4 1L:aan tislattua vettä. Säädetään pH-arvo 7,2 ± 0,2:een HCl:llä.
    2. Natriumkloridi (NaCl).
    3. Natriumfosfaatti (Na2HPO4).
    4. Polyetyleeniglykoli (PEG) (20 000 mol/painoa) Valmistetaan 30-prosenttinen (w/v) PEG-liuos lisäämällä 30 g PEG:tä jokaista 70 ml:aa 70 ml:aa tislattua vettä kohden.
    5. 1 N (tai 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (tai 0,1 N) HCl.
  3. Dialyysikalvon valmistus
    Leikkaa dialyysikalvo niin pitkäksi, että siihen mahtuu tiivistettävä elintarvikeuute. Liota letkua kahdessa vaihdossa tislattua vettä glyserolikerroksen poistamiseksi. Käytetään kalvosulkua tai sidotaan letkun toinen pää kahdella solmulla tiiviisti yhteen. Täytetään putki tislatulla vedellä ja testataan vuotojen varalta puristamalla täytettyä pussia pitäen samalla avointa päätä tiukasti kiinni. Tyhjennä pussi ja aseta se tislattuun veteen käyttökuntoon.
  4. Enterotoksiinin uuttaminen elintarvikeannoksesta

    Huomautus: Tämä menettely ja muut menettelyt, jotka voivat synnyttää patogeenisten mikro-organismien tai enterotoksiinien aerosoleja, on suoritettava hyväksytyssä bioturvallisuuskaapissa.

    1. Mahdollisuuksien mukaan jauhetaan kokonainen ruokatuote tai edustavista valinnoista poimittuja annoksia tehosekoittimessa näytteen homogenisoimiseksi siten, että elintarvikkeessa mahdollisesti esiintyvä SE jakautuu tasaisesti.
      1. Kuorta sisältävien juustojen osalta ota juustonäyte, jossa on 10 % kuorta ja 90 % juustoa.
      2. Kuivattujen tuotteiden osalta käytä yhtä paljon vettä tuotteen kanssa sekoittamiseen tai noudata valmistajan ohjeita.
    2. Punnitse 25 g näytettä lasiseen dekantterilaseihin ja siirrä koe-annos tehosekoittimeen, johon on sekoitettu 40 ml tislattua vettä, ja sekoita suurella nopeudella 3 minuutin ajan, jolloin syntyy tasalaatuista lietettä. Älä lisää vettä nestemäisiin näytteisiin, vaan jatka vaiheeseen 3.
    3. Anna toksiinin diffundoitua ravistelemalla näytettä huoneenlämmössä 30 minuutin ajan.
    4. Hapeta seos 0,1 N HCl:llä pH:n ollessa 3,5 ja 4,0 välillä. Huomautus: jos pH laskee alle 3,0:n, on valmistettava toinen 25 g:n annos.
    5. Siirrä hapotettu liete 50 ml:n kartiomaisiin propyleeniputkiin. Sentrifugoidaan 3 130 × g:llä 20 minuutin ajan 5 °C:ssa. Pienempiä nopeuksia ja pidempää sentrifugointiaikaa voidaan käyttää, mutta joidenkin elintarvikkeiden puhdistaminen ei ole yhtä tehokasta. Rasva-aineiden erottaminen ei ole tehokasta, ellei elintarvikkeita sentrifugoida jäähdytyslämpötilassa.
    6. Tyhjennä supernatantti 800 ml:n dekantterilasiin juustoliinan tai muun sopivan suodatinmateriaalin läpi, joka on sijoitettu erotussuppiloon. Jos supernatantti ei ole kirkas, sentrifugoidaan uudelleen ja dekantoidaan neste juustoliinan läpi. Testataan pH, jonka pitäisi olla 3,5 ja 4,5 välillä. Jos pH on oikea, neutraloidaan seos 0,1 N NaOH:lla, jotta pH on välillä 7,4-7,6.
    7. Jos pH on >4,5, toistetaan happamuudensäätö, mutta jos <3,0 tai=””>9,0, toistetaan prosessi toisella 25 g:n elintarvikeannoksella.
    8. Jos käytettävissä on riittävästi näytettä toistuvaa testausta varten, näytteestä voidaan ottaa näytteenäyte validoitua määritystä varten (ks. kohta H). Jos seulontatulokset ovat negatiiviset, jäljelle jäänyt uute on konsentroitava dialyysillä ja testattava uudelleen.
  5. Uutteen konsentrointi dialyysillä
    1. Laita uute valmiiseen dialyysipussiin. Aseta suljettu pussi alas tarjottimelle ja upota pussi 30 % (w/v) PEG:hen. Pidetään 5 °C:ssa, kunnes tilavuus on pienentynyt 15-20 ml:aan tai vähemmän. Tämä prosessi voi kestää 24-72 tuntia, mutta jos tilavuus ei vähene yön yli kestävän säilytyksen jälkeen, lisätään jauhemaista PEG:tä tarjottimeen. Poistetaan pussi PEG:stä ja pestään ulkopuolelta huolellisesti vedellä, jotta pussiin tarttunut PEG saadaan poistettua. Liota tislatussa vedessä 1-2 minuuttia. Kaada sisältö pieneen dekantterilasiin.
    2. Huuhtele pussin sisäpuoli 2-3 ml:lla tislattua vettä (PBS:ää käytetään maidolle ja maitotuotteille) liikuttelemalla sormia pussin ulkopintaa pitkin ylös ja alas poistaaksesi putken sivuille tarttunutta materiaalia. Toista huuhtelu, kunnes huuhteluvesi on kirkasta. Pidä tilavuus mahdollisimman pienenä.
    3. Säädä uutteen pH-arvo 7,4-7,6:een.
    4. Konsentroidut uutteet on analysoitava 48 tunnin kuluessa ja säilytettävä 3-5 °C:n lämpötilassa, muussa tapauksessa pakasta uutteet 18-20 °C:n lämpötilassa ja sulata kokonaan 3-5 °C:n lämpötilassa ennen testausta. Jotkin määritykset, kuten Vidas SET2, edellyttävät välitöntä analysointia.
  6. SE:n testaaminen bakteeriviljelmistä

    Stafylokokkikannat, joiden epäillään tuottavan enterotoksiineja, voidaan esirikastaa ravintoliemessä, kuten TSB:ssä tai BHI:ssä.

    1. Transferoi kaksi tai kolme morfologisesti samankaltaista pesäkettä 10 mL:aan ravintolientä.
    2. Inkuboidaan 35-37 °C:ssa yön yli orbitaalisella ravistimella.
    3. Sentrifugoidaan viljelmät 5 minuuttia 3500 × g 10 °C:ssa.
    4. Suodatetaan supernatantti Steri-Flip-tyhjiösuodatinlaitteella, jossa on 0,22 µm:n suodatin, tai muulla suljetulla systeemillä, jotta vältetään enterotoksiinien aerosolisoituminen. Tämä toimenpide on suoritettava biologisessa suojakaapissa tutkijan turvallisuuden varmistamiseksi.
    5. Viljelysupernatanteissa voi olla korkeita SE-pitoisuuksia, jotka ovat kitin lineaarisen alueen ulkopuolella, mikä voi vaatia laimentamista PBS:llä.
  7. Tulosten ilmoittaminen

    Elintarvikkeissa havaitun stafylokokki-enterotoksiinin esiintyminen on ilmoitettava liittovaltion valikoiduille agenteille tarkoitetulle ohjelmalle (Federal Select Agent Program), jota hallinnoi tautienvalvonta- ja -torjuntakeskus: https://www.selectagents.gov/form4.html täyttämällä APHIS/CDC:n lomake 4.

    Positiiviset tulokset ilmoitetaan muodossa Stafylokokkientertoksiini havaittu × g (ml) tuotetta. Negatiiviset tulokset ilmoitetaan muodossa Staphylococcal enterotoxin not detected in × g (ml) of product.

  8. Huomautuksia

    Pakkauksen on kyettävä osoittamaan enterotoksiini vähintään tasolla 0,05ng/g suurella suhteellisella herkkyydellä (>90%) ja suhteellisella spesifisyydellä (>90%).

    Menetelmässä olevien kauppanimien tai kaupallisten tuotteiden mainitseminen on tarkoitettu ainoastaan tieteelliseen tiedottamiseen, eikä se tarkoita, että Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto suosittelisi tai hyväksyisi niitä. Kaksi SE:n osoittamiseen yleisesti käytettyä menetelmää ovat AOAC:n hyväksymä Vidas SET2 (bioMerieux, Inc.), joka on automatisoitu moniarvoinen entsyymiin sidottu fluoresenssimääritys (EFLA), joka osoittaa SEA-SEE:n (AOAC Official Method 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods (AOAC:n virallinen menetelmä 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods -menetelmä Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods -menetelmä, Final Action, 2010). Vidas Set2:n nykyinen luettelonumero on Ref. 30705. Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) on manuaalinen entsyymisidonnainen immunomääritys, joka tehdään moniarvoisilla vasta-aineilla päällystetyissä kuopissa. Polyvalentti Ridascreen-pakkaus osoittaa stafylokokin enterotoksiinit SEA-SEE, ja se on validoitu ja todennettu perusteellisissa rengaskokeissa ja kolmansien osapuolten validointitutkimuksissa, joita johti Euroopan unionin koagulaasipositiivisten stafylokokkien vertailulaboratorio Euroopan standardointikomitean (CEN) toimeksiantoa varten ehdottamaa ISO-standardia 19020 varten. Saatavilla on monovalenttinen Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG) -kitti, mutta sitä ei ole validoitu kolmannen osapuolen toimesta. Set Total -monivalenssisarjan luettelonumero on R4105 (96 testiä) tai R4106 (48 testiä). Monovalenttisen SET A,B,C,D,E -kitin luettelonumero on R4101.

Häiriöt

Epäspesifisiä reaktioita voi esiintyä elintarvikkeissa, joissa on endogeenisia entsyymejä, kuten laktoperoksidaasia tai emäksistä fosfataasia, ja ne voivat häiritä Vidas SET2:n kaltaisia paketteja, jotka käyttävät emäksistä fosfataasia detektointi-entsyyminään (Vernozy-Rozand ym. 2005). On suositeltavaa, että kaikki positiiviset tulokset vahvistetaan vaihtoehtoisella menetelmällä, jossa käytetään eri osoitusentsyymiä. Vidas SET2:n tapauksessa yksi vaihtoehtoinen menetelmä on Ridascreen SET Total, joka käyttää laktoperoksidaasia.

Lämpökäsittelyä voidaan käyttää endogeenisen emäksisen fosfataasin poistamiseksi näytteestä seuraavasti:

  • siirretään 600 μL konsentroitua uutetta putkeen
  • kuumennetaan 80 °C:seen 2 minuutin ajaksi
  • Toteutetaan Vidas SET2 -määritys uudelleen jäähtyneellä tiivisteellä. Enterotoksiinia voi hävitä jonkin verran.

Jos epäillään epätarkkaa tulosta Ridascreenillä tai muulla laktoperoksidaasia käyttävällä kitillä, siirrä 100 μL konsentroitua uutetta putkeen. Lisää 50 μl kumpaakin substraatti- ja kromageenisarjan liuosta. Sekoitetaan ja havaitaan sinivihreä väri. Jos sinivihreää väriä esiintyy, se on osoitus siitä, että näytteessä on sisäistä laktoperoksidaasia, joka häiritsee määritystä. Sen vuoksi on käytettävä eri osoitusmenetelmää.

  1. Argudin, MA, Mendoza, MC ja Rodicio MR. Ruokamyrkytykset ja Staphylococcus aureus -enterotoksiinit. Toxins 2010, 2, 1751-1773.
  2. Argudin, MA, Mendoza, MC, Gonzáalez-Hevia, MA, Bances, M, Guerra, B ja Rodicio MR. Elintarvikkeista ja elintarviketyöntekijöistä talteen otettujen Staphylococcus aureus -kantojen genotyypit, eksotoksiinigeenipitoisuus ja mikrobilääkeresistenssi. AEM 2012 78 2930-2935.
  3. Asao, T, Kumeda, Y, Kawai, T, Shibata, T, Oda, H, Nakazawa, H ja Lozaki, S. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimate of of of of entertoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk. Epidemiol. Infect., 2003, 130, 33-40.
  4. Centers for Disease Control/National Institutes of Health. Bioturvallisuus mikrobiologisissa ja biolääketieteellisissä laboratorioissa. Viides painos, 2007, Evenson, ML, Hinds, MW, Bernstein, RS, Befgdoll, MS. Stafylokokki-enterotoksiini A:n ihmisannoksen arviointi suklaamaitoon liittyneestä laajasta stafylokokki-ruokamyrkytysepidemiasta. Int J Food Microbiol 1988, 31, 311-316.
  5. Gutiérrez, D, Delgado, S, Vázquez-Sánchez, D, Martinez, B, Caba, ML, Rodriguez, A, Herrera, JJ ja Garcia, P. Staphylococcus aureus -bakteerin esiintyvyys ja siihen liittyvien bakteeriyhteisöjen analyysi elintarviketeollisuuden pinnoilla. AEM 2012, 78, 8547-8554.
  6. Hennekinne, JA, Ostyn, A, Fuillier, F, Hervin, S, Prufer, AL ja Dragacci, S. How Should Staphylococcal Food Poisoning Outbreaks be Characterized? Toxins, 2010, 2, 2106-2116.
  7. Hennekinne, JA, De Buyser, MA, ja Dragacci, S. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev, 2012, 36, 815-836.
  8. Kluytmans, JAJW, ja Wertheim, HFL. Staphylococcus aureuksen nenäkuljetus ja nosokomiaalisten infektioiden ehkäisy. Infection 2005, 33, 3-8.
  9. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M-A, Roy SL, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 2011 Jan. http://www.cdc.gov/EID/content/17/1/7.htm
  10. Vernozy-Rozand, C., Mazuy-Cruchaudet, C., Bavai, C. ja Richard, Y. (2004), Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food. Lett App Microbiol, 2004, 39, 490-494 . doi:10.1111/j.1472-765X.2004.01602.x

.

Leave a Reply