Polyomaviruksesta peräisin olevan DNA-proteiinikompleksin ja kapsomeerien alayksiköiden karakterisointi käsittelemällä polyomaviruksesta peräisin olevia DNA-proteiinikomplekseja ja kapsomeerien alayksiköitä käsittelemällä niitä etyleeniglykoli-bis-N,N’-tetraetikkahappo ja ditiotreitoli
Polyomavirionien käsittely etyleeniglykoli-bil-N,N’-tetraetikkahapolla (EGTA) ja ditiotreitolilla (DTT) pH 8:ssa.5 johti virionien dissosioitumiseen DNA-proteiinikompleksiksi ja yksittäisiksi rakenteellisiksi kapsomeeri-alayksiköiksi. DNA-proteiinikompleksin sedimentaatioarvo sakkaroosigradientissa oli noin 48S, ja sen tiheys oli 1,45 g/cm3 tasapainoisessa CsCl-gradientissa. Tämän DNA-proteiinikompleksin sisältämän DNA:n emäksinen sakkaroosianalyysi osoitti, että noin 75 prosenttia DNA:sta on komponentti 1. DNA:han liittyvät proteiinit dissosioitiin käsittelemällä ne joko NaCl:llä tai anionisella detergentillä Sarkosyl. VP1 ja histoniproteiinit VP 4–7 olivat tärkeimmät DNA:han assosioituneet proteiinit. DNA-proteiinikompleksin käsittely emäksisellä pH:lla johti FP1:n spesifiseen poistumiseen. 48S-DNA-proteiinikompleksin elektronimikroskopia osoitti, että se on hyvin tiukasti kierteinen rakenne, joka on hieman suurempi kuin ehjä virioni. Kompleksin käsittely joko NaCl:llä tai pH 10,5 -puskurilla johti proteiinin häviämiseen ja sen jälkeen DNA-proteiinikompleksin löystymiseen siten, että DNA voitiin visualisoida. EGTA-DTT-käsittelyn seurauksena vapautuneet kapsomeerin alayksiköt sedimentoituivat 18S-, 12S- ja 5S-alayksikköinä sakkaroosigradientissa. Eristettyjen kapsomeerien elektroforeettinen analyysi osoitti, että VP1, VP2 ja VP3 esiintyivät kussakin lajissa, vaikka proteiinien suhteet vaihtelivat. Rakenneproteiinien lisäksi histonien VP 4–7 havaittiin liittyvän pääasiassa 5S-kapsomeerin alayksikköön.
Leave a Reply