Origin of the electrophoretic force on DNA in solid-state nanopores

Makromolekyylien jänniteohjattu kulkeutuminen biologisten6,7 ja keinotekoisten8,9,10,10,11,12 nanohuokosten läpi tarjoaa ihanteellisen systeemin translokaatioprosessin fysiikan tutkimiseen13. Elektroforeettinen migraatio on tärkein liikkeellepaneva voima DNA:n translokaatiossa nanohuokosten läpi, ja se on seurausta voimasta, jonka ulkoisesti sovellettu sähkökenttä aiheuttaa polyelektrolyyttiketjun varauksiin. Koska liuoksessa oleva DNA on negatiivisesti varautunutta, sitä suojaa kerros enemmän tai vähemmän liikkuvia, positiivisesti varautuneita vastaioneja, joihin myös kohdistuu sähkökenttä. Jo pitkään on tunnustettu, että vastaliittimiin kohdistuva voima aiheuttaa DNA:han hydrodynaamisen vetovoiman, joka paikallisesti tasapainottaa sähköisen voiman, mikä johtaa paljon hitaampaan siirtymiseen kuin mitä pelkän Stokesin vetovoiman perusteella voitaisiin odottaa (ks. esim. viite 1). Polymeerin elektroforeettinen siirtyminen pienen huokosen läpi noudattaa samankaltaisia periaatteita, mutta tässä tapauksessa huokosen geometrian (tai geelin paikallisen rakenteen) odotetaan vaikuttavan merkittävästi hydrodynaamiseen virtausprofiiliin DNA:n ympärillä ja siten liikettä vastustavaan vetovoimaan1,5,14. Huolimatta yhä kehittyneemmistä kokeista3,12,15,16, hydrodynaamisten vuorovaikutusten yksiselitteistä ilmenemistä DNA:n translokaatiossa ei ole vielä raportoitu. Tässä käsittelemme tätä kysymystä käyttämällä hiljattain kehittämäämme laitetta, jossa yhdistetään kiinteän tilan nanoporeja ja optisia pinsettejä3 DNA:n translokaation pysäyttämiseksi ja sen jälkeen yksittäiseen DNA-juosteeseen kohdistuvan pysäytysvoiman mittaamiseksi (ks. jakso ”Menetelmät”). Mittauslaitteiston kaaviokuva on esitetty kuvassa 1a.

a, Mittauslaitteiston kaaviokuva. Optisten pinsettien avulla DNA:n translokaatio pysäytetään ja DNA:han kohdistuva voima mitataan. Samanaikaisesti mitataan myös nanohuokosen ionijohtokyky. b, Lieriömäinen malli DNA:sta nanohuokosessa. Siniset nuolet DNA:n molemmin puolin kuvaavat kaavamaisesti liikkuvan nesteen nopeutta sähköosmoosin vuoksi.

Toisin kuin geelielektroforeesikokeessa, nanohuokoskokeessa sähkökenttä rajoittuu huokosen välittömään läheisyyteen, ja sähköiset voimat vaikuttavat paikallisesti lyhyeen DNA:n segmenttiin. Sähkökentän voimakkuus huokosessa on tyypillisesti ∼106 V m-1 johtuen hyvin ohuista (∼60 nm) vapaasti seisovista kalvoista. λ-DNA:n suuri pysyvyyspituus, noin 50 nm, takaa sen, että huokosen sisällä oleva DNA-segmentti on käytännössä täysin laajentunut. Tilanne on esitetty kaavamaisesti kuvassa 1b, jossa L ja R edustavat huokosen pituutta ja sädettä ja ΔV on sovellettu potentiaali. DNA:n paljaan viivan varaustiheys λbare=-0,96 nC m-1 (2 elektronia per emäspari) ja se mallinnetaan tässä yhtenäisesti varautuneena sylinterinä, jonka säde on a=1,1 nm. DNA:n selkärankaan kohdistuva paljas sähköstaattinen voima on Fbare=λbareΔV (viite 3). Sitä vastustaa vetovoima Fdrag, joka aiheutuu vastaionien vastakkaiseen suuntaan tapahtuvasta elektroforeettisesta liikkeestä: Fdrag on siis translokaatioprosessin luontainen komponentti, joka on viime kädessä palautettavissa myös sähköisiin voimiin5. Tuloksena syntyvä nettovoima on translokaatiota ohjaava elektroforeettinen voima, joka on Felec=Fbare-Fdrag. Meidän tapauksessamme Feleciä tasapainottaa optisten pinsettien aiheuttama mekaaninen vastavoima Fmech=-Felec, joka pidättää DNA:n huokosen sisällä.

Fdragin alkuperä on ionien spatiaalisessa jakautumisessa ja vastaavassa nesteen virtausprofiilissa. Ionijakaumien keskikenttäkuvaus saadaan Poisson-Boltzmannin formalismilla, jossa sähköstaattinen potentiaali on ja vastaavat ionijakaumat . Tässä λD on Debyen pituus, on redusoitu sähköstaattinen potentiaali, e on alkeisvaraus, Φ on potentiaali, kB on Boltzmannin vakio, T on lämpötila, n on ionien lukumäärätiheys ja z on ionilajin valenssi. Kuvassa 2a esitetään lasketut potentiaalit kahdelle huokoskoolle, jotka on saatu Poisson-Boltzmannin yhtälön numeerisella arvioinnilla sylinterimäisessä geometriassa (ks. jakso ”Menetelmät”). Vastaavat ionijakaumat on esitetty kuvassa 2b. DNA:n Debye-kerrokselle on ominaista koionien köyhtyminen, kun taas vastaionit kasaantuvat hyvin suuriksi tiheyksiksi DNA:n suuren varauksen vuoksi. Koska nämä jakaumat ovat täydellisen (epälinearisoidun) Poisson-Boltzmannin yhtälön ratkaisuja, Manningin kondensaation vaikutus17 on otettu huomioon.

a, Pelkistetty sähköstaattinen potentiaali ”suurelle” huokoselle (vihreä, R=10 nm) ja ”pienelle” huokoselle (sininen, R=3 nm). Harmaa viiva osoittaa huokosen seinämän sijainnin pienessä huokosessa. Suolakonsentraatio on cbulk=20 mM (λD=2,2 nm), ja huokosten seinämät pidetään tässä laskennassa yksinkertaisuuden vuoksi varauksettomina. b, Vastaavat ionijakaumat. ”Suurissa” huokosissa (R≫λD) huokosseinämä ei vaikuta merkittävästi ionien jakautumiseen DNA:n ympärillä, kuten havainto osoittaa, että vihreät käyrät saavuttavat bulkkiarvon. Sen sijaan ”pienissä” huokosissa (R≲λD) huokosen seinämä puristaa vastaionipilveä (yhtenäiset käyrät), ja huokos voi tyhjentyä koioneista (katkoviivoitetut käyrät), jolloin jäljelle jää lähinnä positiivisia vastaioneja tasapainottamaan DNA:n negatiivisia varauksia. Tätä tilannetta havainnollistavat siniset käyrät. c, Nesteen nopeusprofiilit, jotka on laskettu yhdistämällä a:n ja b:n tulokset Stokesin yhtälön avulla. d, Leikkausjännityksen normalisoitu pintaintegraali kussakin asennossa r, joka on laskettu kaavalla , jossa τ on nesteen leikkausjännitys. DNA:n pinnalla . e, Lasketut redusoidut pintapotentiaalit DNA:lle (punainen) ja nanohuokosen seinämälle (harmaa) huokosen säteen funktiona. Harmaa alue kuvaa kvalitatiivisesti ”pienten huokosten” aluetta, jossa ionijakaumiin vaikuttaa nanohuokosen rajoittuneisuus.

DNA:n pysähtymiskokeessamme vastaionien jakauma määrää suurelta osin indusoidun elektroosmoottisen virtauksen nopeusprofiilin. Virtauksen nopeusprofiili voidaan laskea ratkaisemalla Stokesin yhtälö , jossa η on nesteen dynaaminen viskositeetti, vz on nesteen nopeus, Ez on sovellettu sähkökenttä ja ρ(r) on ionien varausjakauma. Lasketut nesteen virtausprofiilit on esitetty kuvassa 2c. Jotta virtausprofiili voitaisiin suhteuttaa viskoosivastukseen, nesteen leikkausjännitys lasketaan seuraavasti: τ(r)=-η(dvz/dr). Kuvassa 2d on , joka on yhtä suuri kuin suhde Fdrag/Fbare, kun sitä arvioidaan DNA:n pinnalla (r=a). Se osoittaa, että Fdrag on samaa suuruusluokkaa kuin pelkkä sähköstaattinen voima, joka vaikuttaa DNA:han, jota se vastustaa. Fdrag on suurempi suuremmalle huokoselle, mikä vastaa pienempää pysäytysvoimaa.

Vertaillaksemme kokeisiimme on kätevää ilmaista yllä oleva malli muodossa, jossa elektroforeettinen voima suhteutetaan suoraan nanohuokosen ominaisuuksiin. Kuten aiemmin osoitettiin5, Poisson-Boltzmannin ja Stokesin yhtälöt voidaan yhdistää, jolloin saadaan lauseke paikallaan olevaan molekyyliin kohdistuvalle elektroforeettiselle voimalle,

Φ(a) ja Φ(R) ovat DNA:n ja nanohuokosen pintapotentiaalit ja ε on veden dielektrisyysvakio. ja Poisson-Boltzmannin yhtälöstä johdetut potentiaalit on piirretty kuvassa 2e R:n funktiona. Suurissa huokosissa pintapotentiaalit ovat riippumattomia R:stä. Yhtälö (1) ennustaa tällöin, että mitatulla voimalla Fmech on yksinkertainen ln-1(R/a) -riippuvuus huokosen koosta. Pienemmissä huokosissa Debye-kerros sen sijaan puristuu huokosen seinämään (kuva 2). Tämä johtaa pintapotentiaalien riippuvuuteen huokoskoon mukaan ja vastaavasti Fmechin monimutkaisempaan riippuvuuteen R:stä.

Tapa testata suoraan edellä esitettyä mallia on mitata DNA:n pysäytysvoima Fmech huokosen säteen R funktiona. Koska aiemmissa töissä on kuitenkin keskitytty pienempiin huokosiin, osoitamme aluksi, että on mahdollista havaita yksittäisen DNA-molekyylin läsnäolo hyvin suurissa (R≫a) nanohuokosissa. DNA:n havaitseminen huokosessa perustuu ionijohtokyvyn ΔG:n askeleen mittaamiseen, kun DNA astuu huokoseen. ΔG:n on aiemmin osoitettu johtuvan kahden tekijän välisestä kilpailusta: tilavuuden poissulkemisesta, joka pienentää johtavuuteen käytettävissä olevien ionien määrää, ja DNA:n vastaionien ylijäämästä, joka tehokkaasti lisää johtavuuteen käytettävissä olevien ionien määrää12. Se, kumpi näistä kahdesta vaikutuksesta on hallitseva, riippuu elektrolyytin bulkkikonsentraatiosta, minkä vuoksi ΔG on positiivinen (johtavuus kasvaa) näissä kokeissa, joissa käytettiin 20-50 mM suolaa. Näissä optimoiduissa suolaolosuhteissa DNA:n sieppauksen signaali-kohinasuhteen ennustetaan olevan korkea jopa hyvin suurissa huokosissa18. Kuvassa 3a on esitetty tyypillinen vaihe virrassa ja sitä vastaava muutos helmiäisen Z-asemassa. Havaitaan selvä askel virrassa, vaikka DNA muuttaa nanohuokosen johtavuutta alle 1 %. Tyypillinen kaappaustapahtumien histogrammi on esitetty kuvassa 3b. Nämä tiedot osoittavat, että pystymme kontrolloidusti lisäämään ja havaitsemaan yksittäisiä molekyylejä jopa nanohuokosiin, joiden R=45 nm, jolloin DNA peittää vain 1/2000-osan nanohuokosen poikkipinta-alasta.

a, Tyypillinen esimerkki huokosvirrasta I (ylempi paneeli, punainen keskiarvo) ja helmiäisen sijainnista Z (alempi paneeli) DNA:n kaappauksen aikana R=39 nm:n huokoksessa 33 mM KCl:ssa 80 mV:n jännitteellä. Virtamittaukset alipäästösuodatettiin 1 kHz:n taajuudella. b, Histogrammi ΔG:stä 88:sta nanohuokosessa tapahtuneesta DNA-kaappauksesta samoissa olosuhteissa kuin a-kohdassa. c, ΔG eri säteillä olevissa huokosissa. Sieppaustapahtumat tapahtuivat tyypillisesti 60-100 mV:n jännitteillä. Vaakasuora katkoviiva on ohjeellinen. Kolmiot: 20 mM KCl, tähdet: 33 mM KCl, timantit: 50 mM KCl, vihreä tähti: b:n tiedot, virhepalkit: ΔG-histogrammien perusteella arvioitu keskihajonta. Avoimet symbolit edustavat dataa vapaan translokaation kokeista ilman optisia pinsettejä.

Kokeellisesti määritetyt ΔG-arvot nanohuokosten säteen funktiona on esitetty kuvassa 3c 10 nanohuokokselle, joiden säteet vaihtelevat välillä R=3-45 nm. Harmaa alue osoittaa ”pienen huokosen” aluetta, jossa kuvan 2b laskelmien mukaan nanohuokosen seinämän läsnäolo vaikuttaa ionijakaumiin lähellä DNA:ta. Ilmeisesti simulaatioiden mukaisesti ΔG on suunnilleen vakio suurissa nanohuokosissa. Suurempi ΔG pienissä nanohuokosissa on sopusoinnussa diffuusin seulontakerroksen kokoonpuristumisen kanssa, mikä takaa varauksen neutraalisuuden huokosessa. Mitatun ΔG:n kvantitatiivisempi vertailu teoriaan on kuitenkin vaikeaa: pääsyresistanssista Racc tulee yhä tärkeämpi osa järjestelmän kokonaisresistanssia suurissa huokosissa19 , ja tällä hetkellä ei tiedetä, miten huokosen läpi kulkevan DNA:n läsnäolo vaikuttaa Racciin.

Valmistettuamme, että DNA-molekyylien pysäyttäminen ja havaitseminen on mahdollista sekä suurissa että pienissä huokosissa, siirrymme nyt tämän kirjeen tärkeimpään tulokseen eli kokeellisesti määritettyyn pysäyttävän voiman suuruuteen Fmech nanohuokosen säteen R funktiona. Kuvassa 4a on esitetty Fmech sovelletun jännitteen ΔV funktiona nanohuokosissa, joiden mitat ovat R=4 nm (vasen paneeli) ja R=39 nm (oikea paneeli). Tämä suhde on suunnilleen lineaarinen molemmissa tapauksissa. Fmech/ΔV on kuitenkin pienessä huokosessa kaksi kertaa suurempi kuin suuressa huokosessa. Kuvassa 4b esitetään suhde Fmech/ΔV huokoskoon funktiona: Fmech/ΔV pienenee asteittain huokoskoon kasvaessa, kuten yhtälön (1) perusteella odotettiin. Katkoviivoitettu käyrä saadaan yhdistämällä koko DNA:n varauksen pintapotentiaalit (kuva 2e) yhtälöön (1) ilman lisäsäätöjä. Yksiulotteisen mallin luontaisista yksinkertaistuksista huolimatta teoreettinen tulos kuvaa aineiston suuntausta melko hyvin, vaikka se yliarvioi pysähtymisvoiman määrällisesti ∼50 %. Tämä ero voi johtua useista tekijöistä (niiden yhdistelmästä), kuten vastaionien liikkuvuuden vähenemisestä DNA:n pinnalla12,20 tai ylimääräisestä vastakkaisesta elektroosmoottisesta nestevirtauksesta, joka johtuu nanohuokosten pinnalla olevista kiinteistä varauksista5. Yhtälön (1) mukaisesti molemmat vaikutukset voidaan esittää pienentämällä pintapotentiaalieron suuruutta ΔΦ=Φ(a)-Φ(R), jolloin Fmechin suuruus pienenee. Kun ΔΦ:ää pienennetään empiirisesti 33 prosentilla, saadaan kuvan 4b yhtenäinen käyrä, joka sopii erinomaisesti kokeellisiin tietoihin. Tämä ΔΦ:n pienentäminen vastaa sitä, että noin 50 % DNA:n paljaasta varauksesta on seulottu sen pinnalle tehokkaasti immobilisoituneilla ioneilla (kuten täydentävässä kuvassa S1 on esitetty) tai että huokosen seinämässä on 15 mC m-2 :n pintavaraus (täydentävä kuva S2). Vaikka kokeessamme ei voida suoraan erottaa näitä kahta mekanismia toisistaan, päätelty pintavaraustiheys on tyypillinen SiO2-pinnoille21. Tämä viittaa siihen, että valmistusprosessi ei vaikuta voimakkaasti nanohuokosissamme olevaan pintavaraustiheyteen ja että huokosten varaus aiheuttaa merkittävän osan havaitusta korjauksesta.

a, Pysäytysvoiman mittaukset sovelletun potentiaalin funktiona pienessä (vasen paneeli) ja suuressa nanohuokosessa (oikea paneeli). Kussakin tapauksessa on esitetty kaksi mittausta, jotka on saatu eri etäisyyksillä helmiäisen ja nanohuokosen välillä. b, Mitattu voima huokosen säteen funktiona. Siniset ja vihreät symbolit vastaavat a-kohdan tietoja. Pienen huokosen alueen tiedot on otettu lähteestä ref. 3. Käyrät edustavat teoreettista tulosta paljaalle DNA-varaukselle (katkoviiva) ja pienennetylle ΔΦ:lle (yhtenäinen viiva, ks. teksti). Sisäkuvassa on esitetty kaavamaisesti, miten DNA:n vastaionien voima jakautuu DNA:n ja huokosen seinämien välillä viskoosin vastuksen kautta pienessä ja suuressa huokosessa; keltainen nuoli edustaa DNA:han vaikuttavaa pelkkää sähköstaattista voimaa. Kolmiot: 20 mM KCl, tähdet: 33 mM KCl, timantit: 50 mM KCl. Virhepalkit johtuvat optisen ansan kalibroinnin epävarmuuksista, jotka ovat arviolta 10-30 % kalibroidusta ansan jäykkyydestä.

Pysäytysvoiman absoluuttiseen arvoon saattavat vaikuttaa myös ulkoiset tekijät, joita ei ole otettu huomioon yksinkertaisessa mallissamme. Se voi olla esimerkiksi sähköstaattisten ja/tai hydrodynaamisten voimien aiheuttama, jotka kohdistuvat helmiosaan tai siihen DNA:n osaan, joka sijaitsee sähkökentässä aivan nanohuokosen ulkopuolella. Kokeissamme ei kuitenkaan ole todisteita tällaisista vaikutuksista, sillä emme havainneet pysäytysvoiman muuttuvan, kun helmi sijoitettiin yhä kauemmaksi nanohuokosesta3. Lisäksi kokeelliset voima-jännitekäyrät ovat lineaarisia jännitealueellamme (kuva 4a), mikä osoittaa, että entrooppiset voimat ovat pieniä verrattuna sähköstaattisiin voimiin, mikä on johdonmukaista DNA:n venyttämisessä esiintyvien entrooppisten voimien riippumattomien mittausten kanssa22.

Mitatun voiman riippuvuus huokosen säteestä kuvassa 4b osoittaa suoraan, että DNA:n translokaatiossa esiintyvä elektroforeettinen voima määräytyy osittain DNA:n vastaliittymien ja nanohuokosen seinämän välisestä hydrodynaamisesta kytkennästä. Nanohuokosten geometria määrittää näiden vastaionien DNA:han kohdistaman vetovoiman suuruuden. Tällä kytkennällä on tärkeitä seurauksia kokeellisesti määritettyjen voimien tulkintaan, koska nämä voimat eivät selvästikään määräydy pelkästään DNA:n luontaisten ominaisuuksien perusteella1,23.

Voiman vaihtelua voidaan odottaa myös suolakonsentraation kasvaessa, koska tämä muuttaa Debye-pituutta ja sitä kautta sekä DNA:n pintapotentiaalia että oletettavasti myös pysäytysvoimaa Fmech. Tätä odotusta mutkistaa kuitenkin se, että myös huokosten pinnan varaustiheys muuttuu huomattavasti suolakonsentraation12 myötä ja että tässä käytetty keskikenttäteoria muuttuu epäluotettavaksi suurilla ionivahvuuksilla. Aiemmissa kokeissa Fmechin havaittiin itse asiassa olevan riippumaton suolakonsentraatiosta aina 1 M:iin asti (viite 3), ja Ghosal5 ehdotti näiden tietojen tulkintaa, joka perustuu malliin, jossa Φ(R) riippuu suolakonsentraatiosta.

Vapaassa DNA:n translokaatiossa palautusvoima Fmech puuttuu, ja se korvataan käytännössä ylimääräisellä Stokesin vetovoimalla FStokes, joka on verrannollinen molekyylin nopeuteen. Molekyyli translokaatio tapahtuu vakionopeudella, jolloin FStokes tasapainottaa elektroforeettisen voiman. Optisella pinsetillä mitatun pysäytysvoiman Fmech ja vapaan DNA:n translokaatiokokeista määritetyn translokaationopeuden vtrans välinen suhde on seuraava4,5,14

Tämä tulos vastaa Stokesin vetovastusta, jonka varaukseton sylinteri kokisi translokaatiossa sylinterinmuotoisen huokosen läpi vakionopeudella vtrans. Fmech ja vtrans ovat siis verrannollisia suureita, jotka liittyvät toisiinsa geometriasta riippuvalla kertoimella. Kokeelliset tiedot3,12 vahvistavat kvalitatiivisesti tämän odotuksen, sillä ne osoittavat, että Fmech ja vtrans ovat todellakin suunnilleen verrannollisia. Kun vtrans lasketaan λ-DNA:n ääriviivan pituutena jaettuna kokeellisesti määritetyllä translokaatioajalla, saadaan vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, jolloin Fmech/vtrans=1 750 pN s m-1 (tiedot 5 nm:n säteisistä huokosista). Yhtälö (2) antaa kuitenkin tälle tekijälle arvon 249 pN s m-1, kun käytetään η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm ja a=1,1 nm. Tämä on seitsemän kertaa pienempi kuin kokeellisesti saatu arvo. DNA:n siirtyminen näiden huokosten läpi tapahtuu siis paljon pienemmällä nopeudella kuin optisilla pinseteillä mitattujen elektroforeettisten voimien ja keskikentän kuvauksen perusteella odotetaan. Koska kaikissa näissä kokeissa käytettiin samanlaisia nanohuokosia, tämä päätelmä viittaa perustavanlaatuisempaan eroon pysähtyneen molekyylin staattisen tilanteen ja translokaatiomolekyylin dynaamisen tilanteen välillä. Vapaassa DNA-translokaatiossa DNA:n konformaatio huokosen ulkopuolella aiheuttaa ylimääräistä vetovastusta liikkuvalle molekyylille24 , mikä saattaa selittää ristiriidan.

Johtopäätöksenä olemme osoittaneet, että nanohuokosessa olevaan DNA-molekyyliin kohdistuva elektroforeettinen voima riippuu huokosen geometriasta. Tämä ei ole odotettavissa yksinkertaisesta elektrostaattisuudesta, mutta se voidaan ymmärtää suoraviivaisesti tarkastelemalla DNA:ta liuoksessa seulovien vastaionien aiheuttamaa hydrodynaamista vastusta. Numeeriset laskelmat, jotka perustuvat keskikenttäyhtälöihin, antavat hyvän kuvauksen mitattujen voimien huokoskokori-riippuvuudesta.