Neutrofiilien diapedesis:

Yksi tulehduksen klassisista piirteistä on polymorfonukleaaristen leukosyyttien (PMN) infiltraatio kudokseen. Jotta tämä tapahtuisi, kiertävien PMN:ien on läpäistävä endoteelin kanssa adheesiovuorovaikutuksia, joiden ansiosta ne voivat aktivoitua, litistyä ja emigroitua mikroverisuonten endoteelivuoren läpi. Näiden adheesiovuorovaikutusten molekyylitekijöitä on tutkittu laajasti, ja vallitsee yleinen yhteisymmärrys tapahtumien kulusta, joka johtaa siihen, että PMN:t joutuvat tilanteeseen, jossa ne voivat emigroitua kudokseen (3, 12). Aluksi kiertävien PMN:ien ja endoteelin välille syntyy heikko adheesiovuorovaikutus, joka johtaa PMN:ien suoltavaan liikkeeseen endoteelia pitkin, ilmiö, jota kutsutaan vierimiseksi. Vierimisen ansiosta PMN pysyy tiiviisti kiinni endoteelissä, ja jos paikallisesti syntyy tulehduksen välittäjäaineita, PMN aktivoituu. Kun PMN on aktivoitunut, ne muodostavat endoteelin kanssa vahvempia adheesiovuorovaikutuksia, jotka johtavat niiden pysähtymiseen. Tämän jälkeen PMN emigroituvat endoteelin läpi. Toisin kuin ensimmäisten adheesiovuorovaikutusten (vieriminen ja adheesio) kohdalla, joiden mekanismeista vallitsee yleinen yhteisymmärrys, PMN:n transendoteeliseen migraatioon liittyvistä mekanismeista tiedetään vain vähän. Jopa peruslähtökohta siitä, emigroituvatko PMN:t endoteelisolujen välistä (parasellulaarinen reitti) vai varsinaisten endoteelisolujen läpi (transsellulaarinen reitti), on kiistanalainen.

Valtion vallitsevan konsensuksen mukaan verenkierrossa olevat PMN:t emigroituvat intravaskulaarisesta osastosta interstitiumiin kulkemalla vierekkäisten endoteelisolujen välistä eli parasellulaarista reittiä käyttäen (11). Sekä in vivo että in vitro -tutkimuksissa, joissa on käytetty elektroni- ja valomikroskopiaa, on havaittu, kuinka PMN:t vaeltavat pseudopodioita endoteelisolujen välissä kulkeutuakseen endoteeliesteen läpi vastauksena kemotaktiseen gradienttiin. Jotta PMN pystyisi käyttämään parasellulaarista reittiä transendoteeliseen migraatioon, vierekkäisten endoteelisolujen välisen adheesiokytkennän on katkeiltava ja endoteelisolujen on irrottauduttava toisistaan riittävästi, jotta PMN pääsee kulkemaan. Monet tulehduksen välittäjäaineet, joita käytetään tulehduksen simuloimiseen in vitro, voivat sinänsä aiheuttaa aukkojen muodostumista viljeltyihin endoteelisolujen monolayereihin eli endoteelisolujen vetäytymistä. Koska endoteelisolujen välisiä suuria aukkoja havaitaan kuitenkin harvoin in vivo -tulehdusmalleissa, tämä ilmiö saattaa edustaa tulehdusvälittäjäaineiden liioiteltua vaikutusta in vitro -järjestelmissä. Viljeltyjen endoteelimonolaarien endoteelien väliset adheesioliitokset ovat alikehittyneitä verrattuna vastaaviin in vivo -järjestelmiin, ja näin ollen tulehdusvälittäjäaineet voivat aiheuttaa helpommin endoteelisolujen vetäytymistä in vitro kuin in vivo (12). Tämän ilmiön in vivo-korrelaatti on lisääntynyt makromolekyylien vuoto endoteelien välisten liitosten läpi, joka on havaittu vasteena tulehdusvälittäjäaineille. Yhdessä in vitro -tutkimukset antavat uskottavuutta ajatukselle, että endoteelisolut voivat erkaantua toisistaan vasteena tulehdusvälittäjäaineille, vaikkakin erkaantumisen laajuus voi olla liioiteltu.

Todisteet siitä, että PMN voi aiheuttaa endoteelisolujen vetäytymistä, ovat pääasiassa peräisin in vitro -tutkimuksista, joissa on käsitelty mekanismeja, jotka liittyvät PMN:ien aiheuttamaan endoteelisolujen vaurioon (12). Tämä vahinko oli luonteeltaan ei-lyyttinen ja ilmeni endoteelisolujen irtoamisena monolayereistä, joita kasvatettiin huokosettomilla pinnoilla. Tämä endoteelisolujen irtoaminen tapahtui 3-6 tuntia sen jälkeen, kun aktivoituneet PMN:t oli kerrostettu endoteelisolujen monolayerien pinnalle, ja sen on katsottu johtuvan PMN:stä peräisin olevasta elastaasista. Koska endoteelisolujen irtoamista havaitaan harvoin in vivo -tulehdusmalleissa, PMN-välitteinen endoteelisolujen irtoaminen näyttää myös olevan in vivo -tapahtuman liioittelua, joka johtuu koeolosuhteista in vitro. Näissä järjestelmissä (endoteelisolujen monokerrokset, joita kasvatetaan huokosettomilla pinnoilla) PMN:n ei anneta siirtyä ja siirtyä pois endoteelisolujen monokerroksesta. Näin ollen ne pysyvät endoteelisolujen läheisyydessä ja jatkavat monokerroksen proteolyyttistä pahenemista, mikä lopulta johtaa endoteelisolujen vetäytymiseen ja sen jälkeiseen irtoamiseen. Jos aktivoituneiden PMN:ien annetaan vaeltaa endoteelisolujen monokerrosten poikki, karkeaa endoteelisolujen vetäytymistä ja irtoamista havaitaan harvoin.

PMN:stä peräisin oleva elastaasi voi aiheuttaa endoteelisolujen vetäytymistä ja irtoamista monokerroksissa. Tämä on analogista proteaasien käytön kanssa endoteelisolujen laajentamisessa, eli proteaasilla käsitellyt solut vetäytyvät ja irtoavat alustasta, mutta proteaasi-inhibiittoreilla käsittelyn jälkeen ne voidaan istuttaa uudelleen ja ne voivat jatkaa kasvuaan normaalisti. Mielenkiintoista on, että sekä endoteelisolujen vetäytyminen että PMN:n transendoteelinen migraatio voidaan estää proteaasin (esim. elastaasin) estäjillä. Nämä jälkimmäiset havainnot osoittavat, että PMN käyttää endogeenista elastaasia indusoidakseen endoteelisolujen vetäytymisen riittävän suureksi, jotta ne voivat kulkea vierekkäisten endoteelisolujen välistä vahingoittamatta niitä. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että elastaasin välityksellä tapahtuva PMN:n transendoteelinen migraatio on hyvin säännelty prosessi, joka ei edellytä PMN:n degranulaatiota (3). Aktivoituneet PMN:t eivät eritä elastaasia solunulkoiseen ympäristöön, vaan pikemminkin ne mobilisoivat elastaasia kalvolle ja lokalisoivat sen migraatiorintamaan, esimerkiksi vierekkäisten endoteelisolujen väliin tunkeutuviin pseudopodioihin. Sitä, että PMN:ien degranulaatio ei ole välttämätöntä niiden transendoteeliaaliselle migraatiolle, tukee myös havainto, että PMN-sytoplastit (anukleaariset PMN:t, joissa ei ole granuloita) vaeltavat endoteelin monokerrosten läpi kemotaktisen gradientin vaikutuksesta yhtä tehokkaasti kuin normaalit PMN:t. Myös tässä tapauksessa sytoplastien transendoteelinen migraatio voidaan estää elastaasin estäjillä.

Endoteelisoluja pitävät yhdessä transmembraaniproteiineista koostuvat adheesiokohdat (11). Jotta neutrofiilit voisivat kulkea endoteelisolujen välistä, näiden liitosten adheesiovuorovaikutukset on siis häirittävä. PMN:n endoteelin läpi tapahtuvan migraation kannalta merkityksellisiä adheesioliitoksia on kaksi: adherens-liitokset ja tiukat liitokset. Adherens-liitokset koostuvat verisuoni-endoteeli (VE)-kadheriini/kateniinikomplekseista. VE-kadheriinilla on solunulkoinen domeeni, joka on homotyyppisesti vuorovaikutuksessa vierekkäisten endoteelisolujen VE-kadheriinin kanssa. VE-kadheriinin sytoplasminen domeeni assosioituu solunsisäisten β- tai γ-kateniinien kanssa. Nämä VE-kadheriini/kateniinikompleksit liittyvät aktiinisytoskelettiin α-kateniinin kautta (kuva 1A). Tiiviit liitokset koostuvat useista transmembraaniproteiineista, mukaan lukien okkludiini ja klausidiinit 1 ja 2, ja niihin liittyvistä solunsisäisistä proteiineista, kuten ZO-1:stä, -2:sta ja -3:sta, jotka yhdistävät tiiviit liitosproteiinit sytoskelettiin. Näistä kahdesta adheesioliitoksesta eniten huomiota on kiinnitetty PMN:n transendoteelisen migraation vaikutukseen adherens-liitoksiin.

Uudet tutkimukset, joissa on käytetty konfokaalimikroskopiaa, osoittavat, että PMN:n adheesiovuorovaikutukset (adheesio ja transendoteelinen migraatio) voivat johtaa adherens-liitosproteiinien paikalliseen hajoamiseen (10). Kaksi PMN-populaatiota otettiin kiinni endoteelisolujen monolayereihin kiinnittyneinä: 1) ne, joiden alapuolella adherens junction -proteiinien jatkuvuus ei ollut häiriintynyt, ja 2) ne, joiden alapuolella adherens junction -proteiinit olivat häiriintyneet. Tarttuvien PMN:ien aiheuttama adherens-liitosten jatkuvuuden katkeaminen oli paikallinen ilmiö, sillä PMN:stä kauempana olevat adherens-liitokset eivät kärsineet. Systemaattinen analyysi osoitti, että adherens junction -proteiinit vaikuttivat adherenttien PMN:n alapuolella peräkkäin, eli β-kateniini hävisi ennen VE-kadheriinia. Transendoteelin kautta tapahtuvan migraation aikana vangittuihin PMN:iin liittyi poikkeuksetta kaikkien adherens-liitosproteiinien häviäminen migraatiokohdassa. Tässäkään tapauksessa adherens-liitoksen eheyteen ei ollut vaikutusta paikoissa, jotka olivat kauempana migroivasta PMN:stä. Lisäksi todisteet adherens-liitoksen häiriöiden merkityksestä PMN:n transendoteelisessa migraatiossa ovat seuraavat: 1) in vivo vasta-aineet VE-kadheriinia vastaan lisäsivät PMN:n emigraatiota ja 2) in vitro vasta-aineet VE-kadheriinia vastaan lisäsivät PMN:n transendoteelista migraatiota ja indusoivat endoteelin aktiinisytoskeletonin uudelleenorganisoitumista, mikä johti endoteelisolujen välisten aukkojen muodostumiseen.

Tiiviiden liittymäkompleksien osalta viimeaikaiset tutkimukset ovat tehneet samankaltaisia havaintoja. PMN:n transendoteelinen migraatio häiritsi ZO-1:n ja -2:n jatkuvuutta vain PMN:n tunkeutumiskohdassa endoteelin välisiin liitoksiin (1). Laajoja epäjatkuvuuskohtia tiiviissä liitoksissa ei havaittu.

Potentiaaliset mekanismit, jotka osallistuvat parasellulaariseen diapedesiin

Mekanismi, jolla PMN:n ja endoteelisolujen adheesiovuorovaikutukset häiritsevät adherens-liitosta, on epäselvä. Yksi mahdollisuus on, että tarttuvat PMN käyttävät endogeenisiä proteaaseja hajottaakseen adherens-liitoksen proteiineja (kuva 1A). Esimerkiksi elastaasin estäjät pystyivät vähentämään PMN:n aiheuttamaa adherens-liitoksen proteiinien VE-kadheriinin ja β-kateniinin häviämistä (2). Muut tutkimukset (11) osoittavat, että aktivoituneet PMN:t voivat hajottaa VE-kadheriinia ja että elastaasin estäjä voi estää tämän hajoamisen. Lisäksi puhdistettu neutrofiilinen elastaasi tuottaa VE-kadheriinin hajoamistuotteita, jotka ovat samankaltaisia kuin ne, joita on havaittu aktivoituneen PMN:n hajotettua tätä adherens-liitoskomponenttia. Kaiken kaikkiaan vaikuttaa todennäköiseltä, että PMN:stä peräisin olevalla elastaasilla on rooli adherens-liitoksen hajoamisessa.

PMN:n ja endoteelisolujen adheesiovuorovaikutukset voisivat myös viestiä endoteelisoluille, että ne osallistuisivat aktiivisesti PMN:n transendoteeliseen migraatioon erottautumalla toisistaan eli muodostamalla interendoteelisen kuilun (interendothelial gap formation) (kuva 1A). Tätä väitettä tukevat seuraavat todisteet. Tarttuvat PMN:t voivat aiheuttaa endoteelisolujen Ca2+-tasojen nousua, ja tämän Ca2+:n kelaaminen johtaa PMN:ien transendoteelisen migraation estymiseen. Lisäksi endoteelin myosiinin kevytketjukinaasin (joka on keskeinen tekijä endoteelisolujen välisen raon muodostumisessa) estäminen vähensi PMN:n transendoteelista migraatiota (11). Lopuksi, kuten edellä todettiin, tarttuvat PMN:t vaikuttavat solunsisäiseen β-kateniiniin ennen plasmakalvoa ylittävää VE-kadheriinia. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että endoteelisolut voidaan saada osallistumaan aktiivisesti PMN:n transendoteeliseen migraatioon vetäytymällä pois toisistaan.

Todisteet transsellulaarisen diapedesin puolesta

Monet varhaiset ja uudemmat raportit, joissa on tutkittu leukosyyttien diapedesiä in vivo ultrastrukturaalisella lähestymistavalla, viittaavat siihen, että suurin osa PMN:istä poistuu verisuonistosta transsellulaarisesti, ts, endoteelin sytoplasman läpäisevien huokosten tai läpivientien kautta. Sarjapoikkileikkausten tutkiminen läpäisyelektronimikroskopian avulla viittaa siihen, että PMN:t voivat vaeltaa sellaisten alueiden läpi, joihin ei liity tunnistettavia solu-soluliitoksia (4, 5, 8). On väitetty, että edes sarjapoikkileikkaus ei yksiselitteisesti todista, että solu- ja soluliitoksen lähellä ei ollut soluliitosta, vaan että se on saattanut jäädä huomaamatta. Lisäksi voi olla vaikeaa tunnistaa elektronitiheitä adherens-liitoksia, erityisesti alueilla, joilla endoteelin korkeus on <0,5 μm. Lopuksi viimeaikaiset in vitro -tiedot viittaavat siihen, että solu-solu-adherens-liitokset hajoavat molekyylisesti PMN:n diapedoosin aikana (10), ja siksi niitä ei odoteta näkevän morfologisesti.

Pyyhkäisevän elektronimikroskoopin kuvat antavat vakuuttavampaa näyttöä siitä, että PMN:t tunkeutuvat endoteelisoluihin aukkojen kautta, jotka eivät liity endoteelisolujen solu-solu-kontakteihin (4, 9). Diapedesioprosessissa olevat PMN:t näyttävät olevan käpälän muotoisia, ja niiden alueella endoteelin tasolla on supistuma (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Riippuen siitä, kuinka pitkälle diapedesis on edennyt, nähdään kuplamainen jatke, joka työntyy joko verisuonen luumeniin tai ulottuu interstitiumiin (5, 9, 11, 15). Tämä osoittaa, että leukosyytit puristuvat halkaisijaltaan pienen ja rajallisen pyöreän huokosen läpi sen sijaan, että ne aiheuttaisivat yksittäisten endoteelisolujen vetäytymistä toisistaan. Endoteelisolu ja leukosyytti pysyvät tiiviissä kosketuksessa koko diapedoosin ajan. Endoteeli näyttää usein levittäytyvän PMN:n pinnan luminaalista puolta pitkin nielaistakseen sen kokonaan ja sulkeakseen näin lumen aukon ennen PMN:n vapautumista kudosmatriisiin (4, 5, 8). Tämä prosessi on usein havaittu emigraation aikana in vivo, mutta sen ei ole osoitettu tapahtuvan transendoteeliperäisen migraation aikana in vitro.

Transsellulaariseen diapedesiin mahdollisesti osallistuvat mekanismit

Vaikka tiukkoja mekanistisia lähestymistapoja on vaikea soveltaa in vivo -tutkimuksiin, on olemassa riittävää aihetodistusaineistoa useiden mahdollisten mekanismien tueksi, joiden avulla PMN:t emigroituvat transsellulaarisesti. On mahdollista, että solunulkoiset huokoset, joiden kautta PMN:t vaeltavat, ovat seurausta endoteelin proteolyyttisestä vaurioitumisesta. On kuitenkin huomautettu, että ainakin ultrastruktuurisesti endoteeli pysyy vahingoittumattomana ja jatkaa kaveolien ja endosytoottisten vesikkelien muodostamista jopa kalvoalueilla, jotka ovat läheisessä kosketuksessa PMN:n kanssa (13). On todennäköisempää, että PMN, jotka näyttävät vaeltavan lyhyitä matkoja pitkin apikaalista endoteelin pintaa, hakeutuvat endoteelin ohuille alueille, kuten aukkoihin. Fenestrae voi olla avoin (halkaisijaltaan 50 nm) tai sitä ympäröi kahden plasmakalvon paksuinen kalvo (jossa ei ole sytoplasmaa). Näin ollen PMN voisi helposti kulkea avoimien fenestrae-kammioiden läpi tai proteolyyttisesti kalvomaisten fenestrae-kammioiden läpi vahingoittamatta varsinaista endoteelia. Fenestrae voi olla tärkeä väylä PMN:n emigraatiolle niissä elimissä, joissa on fenestraattisia mikroverisuonia (esim. ruoansulatuskanavan limakalvo, eritysrauhaset).

Elimissä, joissa on jatkuvia mikroverisuonia (esim. iho, lihakset), PMN voi käyttää kaveoleja tai pinosytoottisia vesikkeleitä ja työntää niihin filopodioita tunkeutuakseen endoteeliesteen läpi. Näiden halkaisijaltaan 50-100 nm:n suuruisten rakenteiden uskotaan välittävän proteiinien kuljetusta endoteelin läpi ja tarjoavan ylimääräisen reitin verisuonten proteiinivuodolle tulehduksen aikana. Hiljattain on osoitettu, että kaveolat muodostavat vesikulo-vakuolaarisia organelleja, jotka voivat muodostaa pieniä jatkuvia kalvoon sidottuja käytäviä endoteelisolun sytoplasman poikki (6). Tällaisten kaveolien ja vesikkelien muodostumisen on osoitettu jatkuvan endoteelin pintakalvon alueilla, jotka ovat kosketuksissa tarttuvien PMN:ien kanssa (13). Lisäksi PMN:t, jotka kiinnittyvät tiiviisti endoteelisolun pintaan, ulottavat usein sormimaisia filopodioita apikaalisen plasmakalvon syvennyksiin ja muokkaavat siten endoteelin pintaa (4, 7, 8). Tarttuvan filopodiumin ulostyöntävä voima muodostuviin vesikulo-vakuolaarisiin organelleihin voi johtaa tämän filopodiumin syntymiseen abluminaaliselle endoteelin puolelle (kuva 1B), jossa se voi helposti olla vuorovaikutuksessa solunulkoisen matriksin kanssa ja levitä sitä pitkin (kuva 1B).

F-aktiini- ja mikrofilamenttikonsentraatio PMN:n johtavissa pseudopodioissa on osoitettu diapedoosin aikana in vivo (15) ja in vitro (3), ja se voi tuottaa voiman, jota tarvitaan eteenpäin etenevien soluprosessien vetämiseen solunulkoisten huokosten läpi. Huokoset voivat laajentua 3-5 μm:n kokoisiksi, joiden läpi leukosyytti voi helposti kulkea. Alkuperäisen vacuolaarisen huokosen laajentuminen voi osittain johtua voimista, jotka syntyvät leukosyytin pallomaisessa osassa, joka vielä työntyy verisuonen luumeniin, olevan kortikaalisen mikrofilamenttijärjestelmän jännityksestä. Siirtyvien PMN:ien kaudaalisella alueella on itse asiassa havaittu F-aktiinikonsentraatio diapedoosin myöhäisvaiheissa (15). Lisäksi endoteelin sytoplasman sytoskeletaalinen uudelleenjärjestäytyminen voi auttaa transendoteelihuokosen laajentumista, kuten aiemmin on esitetty (14). Huokosten muodostumisprosessiin liittyisi endoteelin apikaalisten kalvoalueiden leviäminen PMN-solujen pintaa pitkin, mikä johtaisi siihen, että endoteeli lopulta nielaisee luminaaliset PMN-osat, kuten elektronimikroskooppikuvissa on osoitettu (kuva 1B). Tämä endoteelin aktiivinen osallistuminen auttaisi endoteelin limakalvon nopeaa uudelleen sulkeutumista ja rajoittaisi siten proteiinivuotoa.

Yhteenveto

Tästä todistusaineiston katsauksesta käy ilmi, että PMN voi käyttää sekä parasellulaarisia että transsellulaarisia reittejä läpäistäkseen endoteelin esteen tulehduksen aikana. On syytä huomauttaa, että PMN:n transendoteelinen migraatio in vitro suosii parasellulaarista reittiä, kun taas PMN:n transendoteelinen migraatio in vivo suosii transcellulaarista reittiä. Jos teleologisesti oletetaan, että transmigroiva PMN valitsee pienimmän vastuksen reitin, voi olla selitys in vitro- ja in vivo -lähestymistavoilla saatujen tulosten näennäiselle ristiriidalle.

Viljelyssä kasvatetuissa endoteelisolujen monolayereissä heikentyneimmät alueet ovat lähellä solujen ja solujen välisiä liittymäkohtia, eikä siksi ole yllättävää, että tämä on suosiollinen paikka, jossa diapedesiä tapahtuu. Lisäksi viljellyissä endoteelisoluissa solujen väliset liitoskohdat ovat epävakaita rakenteita, joita puretaan ja kootaan jatkuvasti uudelleen. Siirtyvien leukosyyttien pseudopodiat pääsevät helposti tällaiselle alueelle. On myös todisteita siitä, että jopa in vitro PMN:n diapedesin aikana käyttämä parasellulaarinen reitti on spesifisesti valittu, eli diapedesi tapahtuu mieluummin trisellulaarisissa kulmissa kuin kahden endoteelisolun välissä (1). Adherens-liitokset ja tiukat liitokset ovat epäjatkuvia näissä kolmisoluisissa kulmissa, joten ne muodostavat pienimmän vastuksen polun siirtyvälle PMN:lle. Sitä vastoin endoteelisolujen väliset liitokset ovat paljon paremmin kehittyneitä in vivo ja vastustuskykyisempiä proteiinien liikkumiselle niiden läpi. Näin ollen PMN saattaa suosia endoteelisolujen ohuen alueen huokosia, kuten fenestrae- tai caveolae-alueita, pienimmän vastuksen reittinä.

PMN:n diapedesin aikana käyttämän ensisijaisen reitin (parasellulaarinen vs. transsellulaarinen) osoittaminen sen mukaan, käytettiinkö tätä ilmiötä tutkittaessa in vitro- vai in vivo -menetelmiä vai ei, on erityisesti liiallinen yksinkertaistaminen. Tästä paradigmasta poikkeamisesta on monia esimerkkejä. On esimerkiksi näyttöä siitä, että PMN voi käyttää parasellulaarista reittiä in vivo ja transsellulaarista reittiä in vitro. Lisäksi, jos transsellulaarinen reitti on ensisijainen PMN:n diapedesiin in vivo, miksi liitosproteiinien häiritseminen muuttaa dramaattisesti PMN:n diapedesiä in vivo? Voi hyvin olla, että tämä väittely jatkuu vielä vuosia, aivan kuten väittely siitä, tapahtuuko transendoteelinen proteiinien siirtyminen ensisijaisesti parasellulaarista vai transsellulaarista reittiä pitkin. Voidaan kuvitella, että PMN:n transendoteelista migraatioreittiä koskevat kiistat voivat osittain johtua tulehdusreaktion luonteesta tai sen verisuonipohjan luonteesta, jossa se tapahtuu. Toivottavasti jatkotutkimukset tuottavat lisätietoa, joka mahdollistaa tämän kiistan ratkaisemisen.