Kemiallinen derivatisaatio bioanalytiikassa

Sovellukset

Kemiallinen derivatisaatio on jo pitkään osoittautunut bioanalytiikan analyysitekniikaksi, jolla on voitettu ongelmat, jotka liittyvät heikkoon ionisaatiotehokkuuteen, yhdisteiden epävakauteen, huonoon selektiivisyyteen tai kromatografiseen suorituskykyyn, jota ei voida hyväksyä (huono retentio, huono piikin muoto ja siirtymäkykyyn liittyvät ongelmat), sekä jopa GC-erotuksen huonoon haihtuvuuteen . Tämä tekniikka on tehokas väline monilla kemian aloilla, kuten lääketieteessä, oikeuslääketieteessä, elintarviketieteessä, dopingvalvonnassa ja ympäristötieteissä. Kemiallisen derivatisoinnin tavoitteena on muuttaa analyytin (joko nukleofiilisen tai elektrofiilisen) rakennetta kemiallisella reagenssilla (joko elektrofiilinen tai nukleofiilinen analyytin luonteesta riippuen), minkä tuloksena muodostuu uusi yhdiste (reaktion johdannainen), jolla on paremmat kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet analyysia varten. Reaktio-olosuhteet (reagenssin määrä, reaktioaika ja -lämpötila jne.) optimoidaan siten, että haluttu johdannainen muodostuu mahdollisimman suurella reaktiotuotolla. Näytteen puhdistusmenetelmiä voidaan lisäksi kehittää ei-toivottujen sivutuotteiden ja ylimääräisten reagenssien eliminoimiseksi, jolloin analyysin yhteydessä tehtävät analyyttijohtopäätökset saadaan minimoitua.

Kemiallisen johdannaiskäsittelyn avulla mahdottoman analysoinnista tulee mahdollista. Kirjallisuudessa on esitetty monia esimerkkejä tästä; ne vaikuttavat GC-, LC-MS/MS- ja NMR-ilmaisuun. Merkittävin on ollut enantiomeerien kromatografinen erottaminen kiraalisen derivatisoinnin avulla käyttämällä spesifisiä erotusreagensseja ilman erikoistuneita kiraalisia kolonneja ja erotusolosuhteita.

Harkinta

Tarkoituksenmukaisen kemiallisen reagenssin valinta on olennaisen tärkeää derivatisoinnin onnistumiselle, ja se on riippuvainen erityissovelluksesta. Yleensä, jos kohdeanalyytti on nukleofiili (yhdiste, jolla on ylimääräisiä elektroneja), reagenssiksi valitaan elektrofiili (yhdisteet, joilla on yleinen elektronivaje) ja päinvastoin. Reagenssien on oltava selektiivisiä (kohdistuvat yhteen tiettyyn kohtaan molekyylissä), jolloin vältetään derivatisointi useissa kohdemolekyylin, metaboliittien tai endogeenisten komponenttien kohdekohdissa. Esimerkiksi molekyylissä, joka sisältää sekä hydroksyyli- että aminofunktionaalisia ryhmiä, olisi vältettävä happokloridien tai anhydridien käyttöä derivointireagensseina, koska ne derivatisoivat molemmat funktionaaliset ryhmät. Sitä vastoin dansyylikloridin käyttö derivointireagenssina sopii amino- ja fenolifunktionaalisille ryhmille, koska se ei reagoi alifaattisten alkoholien kanssa. Muita reagenssin valinnassa huomioon otettavia vaatimuksia ovat saatavuus (kaupallisesti), puhtaus ja kustannukset. Tyypillisesti reagenssien kustannukset ovat minimaaliset, eivätkä ne näin ollen ole esteenä käytölle.

Kemialliset derivatisointimenetelmät ovat optimoitujen olosuhteiden avulla tyypillisesti riittävän vankkoja, jotta niitä voidaan soveltaa farmaseuttiseen bioanalytiikkaan, ja ne pystyvät täyttämään lainsäädännölliset odotukset. Tämä osoitetaan yleensä tiukassa validointiprosessissa, jossa useat parametrit, kuten tarkkuus, täsmällisyys, selektiivisyys, matriisivaikutus jne. Sisäisen standardin valinta on olennaisen tärkeää, jotta voidaan korjata mahdollinen analyyttihäviö näytteen käsittelyn ja bioanalyysin eri vaiheissa; näin varmistetaan määrityksen luotettavuus. Mahdollisuuksien mukaan olisi käytettävä deuterium- tai 13C-stabiilia sisäistä standardia, muussa tapauksessa voidaan käyttää analogia, jolla on samanlainen reaktiivisuus, talteenotto ja kromatografiset ominaisuudet. On myös ehdottoman tärkeää ottaa huomioon ja arvioida mahdollisuuksien mukaan kiinnostuksen kohteena olevan analyytin aineenvaihduntareitit; aineenvaihduntatuotteiden muuntumista takaisin kantamolekyyliksi on vältettävä derivatisointimenettelyn aikana, koska näihin prosesseihin liittyy usein vaikeita olosuhteita (pH, lämpö, pitkät inkubaatioajat jne.). Valitettavasti tätä voi vaikeuttaa metaboliittien referenssistandardien puute ja metabolisen tiedon puute lääkekehityksen elinkaaren alkuvaiheessa erilaisten tai nopeutettujen kehitysstrategioiden vuoksi.

Kemiallinen derivatisointi taidemuotona

Kemiallisen derivatisoinnin käyttö on vähentynyt viime vuosina uusien erotustekniikoiden kehittyessä ja yleistyessä. Esimerkiksi ylikriittisen nestekromatografian (Supercritical fluid chromatography, SFC) kehittyminen on avannut uuden tien kiraaliseen stereoisomeerianalyysiin, mikä on vähentänyt kiraalisen derivatisoinnin tarvetta tietyissä tapauksissa. Kolminkertaisen kvadrupolimassaspektrometrisen laitteiston herkemmät sukupolvet, joissa on uusia tai parannettuja ionisointitekniikoita, nostavat havaitsemisrajat alhaiselle pikogrammin tasolle, minkä seurauksena tarve kemialliselle johdannaiskäsittelylle määrityksen herkkyyden parantamiseksi (parantamalla ionisaatiota tai selektiivisyyttä) on vähentynyt. Muut tekniikat, kuten UHPLC, mikro-/nano-LC (paremman ionisaatiotehokkuuden saavuttamiseksi) ja TOF-laitteet, joissa on ioniliikkuvuusominaisuudet (elektroninen erottelu kemiallisen/fysikaalisen erottelun sijaan), ovat myös osaltaan vähentäneet kemiallista derivointia bioanalyyttisessä laboratoriossa. Tätä tekniikkaa käytetään kuitenkin edelleen hyvin monimutkaisissa erotteluissa, joissa edellä mainituilla tekniikoilla ei ole riittävää vaikutusta. Joskus kemiallisen derivatisoinnin yhdistäminen johonkin näistä tekniikoista parantaa/lisää vaikutusta. Erityisesti SFC:n ja kiraalisen derivatisoinnin yhdistelmä on osoittautunut paremmaksi kiraalisessa erottelussa verrattuna SFC-analyysiin (tietoja ei ole esitetty).

Tekniikan vähenemisen ja sen monimutkaisuuden vuoksi verrattuna muihin analyysitekniikoihin kemiallisesta derivatisoinnista on kehittynyt laboratoriossa erityinen ”taiteenlaji”, joka vaatii erikoistaitoja yhdistettynä vahvaan kemian osaamiseen. Tämän seurauksena yhä harvemmat tutkijat DMPK-ympäristöissä onnistuvat hallitsemaan tekniikan ja tulemaan taitaviksi sen soveltamisessa. Kysymys kuuluukin, miten nämä taidot voidaan säilyttää ja siirtää tuleville analytiikan tutkijasukupolville. Tämänkaltaiset erikoisnumerot, katsausartikkelit, kirjanluvut ja kokeellisia protokollia sisältävät ohjeet toivottavasti helpottavat ja edistävät kemiallisen derivatisoinnin käyttöä loistavana analyysivälineenä.

Outline

Tässä teemanumerossa käsitellään bioanalyyttisessä tutkimuksessa käytettävien nykyisten derivatisointitekniikoiden edistysaskeleita sekä innovatiivisia uusia menetelmiä ja lähestymistapoja (esim, derivatisoinnin yhdistäminen mikrovirtaus-LC-MS:ään ja Niwan ym. ajatus uusista kemiallisista merkintätekniikoista).

Numerossa pyritään käsittelemään näkökohtia, jotka liittyvät seuraaviin aiheisiin:

• Derivatisointimenetelmät LC-MS:n bioanalytiikassa (mukaan lukien HPLC);

• Peptidien derivatisointi proteiiniterapeuttisten aineiden analysoinnissa;

• kiraaliset derivatisointireagenssit sovellettuna biologisiin näytteisiin (ks. Vashistha et al. );

• Derivatisointi endogeenisten yhdisteiden analysointiin (ks. ”Beyond Classical Derivatization: Analyte ’derivatives’ in bioanalysis of endogenous and exogenous compounds”, Barnaby et al. tai ”Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses”, Marcos et al. );

• Derivatisointimenettelyt ihmisten dopingvalvonnassa (ks. mielenkiintoinen katsaus Athanasiadou et al. ).

Kaikkakin on totta, että kemiallinen derivointi on vain yksi väline bioanalytiikan työkalupakissa, se on DMPK-laboratorion ”must have”, ja sillä on jatkossakin vaikutusta monien bioanalyyttisten haasteiden ratkaisemiseen.

Sentähden, jos et pidä analyytistäsi, vaihda se (kemiallisella derivatisoinnilla siis)!