Katsaus klassisiin histonideasetylaasientsyymeihin ja histonideasetylaasin estäjiin

Kuva 2

Yleiskatsaus histonideasetylaasin (HDAC) inhibiittoreiden biologisiin vaikutuksiin pahanlaatuisissa ja transformoituneissa soluiss a , käyttäen esimerkkinä natriumbutyraattia (NaB). (a) Yksinkertaistettu kaavamainen esitys molekyylireiteistä, jotka selittävät HDAC:n estäjien kliinisen potentiaalin syövän hoidossa. Histonien asetylaatiotilaa säätelevät histoniasetyylitransferaasien (HAT) ja HDAC:ien vastakkaiset toimet. HDAC:n estäjät välittävät syövänvastaisia vaikutuksia histonihyperasetylaatiosta johtuvien muutosten (Δ) kautta tiettyjen geenien ilmentymisessä ja olemalla suoraan vuorovaikutuksessa lukuisten keskeisten solunsisäisten muiden kuin histoniproteiinien, kuten α-tubuliinin, lämpösokkiproteiini 90:n ja Ku70:n kanssa. HDAC:n estäjät johtavat 2-20 %:n geenien transkriptionaaliseen aktivoitumiseen ja repressioon; osa näistä geeneistä liittyy erilaistumiseen, solusyklin pysähtymiseen, apoptoosiin, kasvun estoon ja solukuolemaan sekä syöpäsolujen migraation, invaasion ja angiogeneesin estoon. (b) Natriumbutyraatin (NaB) biologiset vaikutukset syöpäsoluissa ja normaaleissa soluissa. (i) Natriumbutyraatti aiheuttaa histonien hyperasetylaatiota H9c2-sydänlihassoluissa. Soluja erilaistettiin 10 nM all-trans-retinoiinihapolla 7 päivän ajan matalan seerumin mediassa ennen 24 tunnin inkubaatiota 2 ja 5 mM natriumbutyraatilla. Solujen kokonaislysaatit immunoblotattiin asetyloidun histoni H3:n suhteen, ja modifioimatonta histoni H3:a käytettiin latauskontrollina. (ii) Natriumbutyraatti vähentää solujen elinkykyä K562-ihmisen erytroleukeemisissa soluissa ja H9c2-sydänlihassoluissa. Soluja käsiteltiin ilmoitetuilla natriumbutyraattipitoisuuksilla 24 tunnin ajan, ja solujen suhteellinen elinkyky mitattiin Cell Titer blue (Promega) assay kitillä. (iii) Natriumbutyraatti indusoi apoptoosia K562-soluissa. Soluja käsiteltiin 10 mM natriumbutyraatilla 24 tunnin ajan, ja kaspaasi 3/7 -aktiivisuus mitattiin Apo-ONE Homogeneous (Promega) assay kitillä. (iv) Natriumbutyraatti saa K562-solut pysähtymään solusyklin G1-vaiheeseen. Käsittelemättömät solut (ylhäällä) ja solut, joita käsiteltiin 5 mM natriumbutyraatilla (alhaalla) 24 tunnin ajan, värjättiin propidiumjodidilla, ja solusyklijakauma tutkittiin virtaussytometrialla.

Lyhyesti sanottuna HDAC:n estäjät johtavat hyperasetyloidun histonin kerääntymiseen, ja niiden on osoitettu muuttavan noin 2-20 %:n geenien ilmentymistä pahanlaatuisissa solulinjoissa . Kaiken kaikkiaan HDAC-inhibiittoreiden on osoitettu vähentävän solujen proliferaatiota, indusoivan solukuolemaa, apoptoosia ja erilaistumista, aiheuttavan solusyklin pysähtymistä (G1 pienemmillä pitoisuuksilla ja sekä G1 että G2/M suhteellisen korkeilla pitoisuuksilla) ja vähentävän migraatiota, invasiota ja angiogeneesiä pahanlaatuisissa ja transformoituneissa solulinjoissa . HDAC:n estäjien vaikutukset ovat paljon vähäisemmät, vähintään kymmenkertaiset, normaaleissa soluissa, mikä on perusta niiden kliiniselle hyödylle syövässä . HDAC:n estäjien terapeuttisen indeksin parantamiseksi syöpähoidossa on ehdotettu luokkaselektiivisiä tai isoformispesifisiä yhdisteitä. Tässä yhteydessä esimerkkeinä voidaan mainita isoformispesifiset tubasiini ja PC-34051, jotka estävät selektiivisesti HDAC6:ta ja HDA8:aa. Molemmilla yhdisteillä on äskettäin osoitettu olevan syövänvastaisia vaikutuksia. Kysymys selektiivisyydestä on kuitenkin edelleen kiistanalainen, ja on esitetty väitteitä, joiden mukaan laajakirjoisten HDAC:n estäjien, jotka ovat yleensä hyvin siedettyjä, pleiotrooppiset vaikutukset voivat olla eduksi syövän hoidossa, kun otetaan huomioon pahanlaatuisten solujen heterogeenisuus ja sopeutumiskyky. Yleisesti hyväksytään kuitenkin, että selektiiviset yhdisteet ovat todennäköisesti hyödyllisempiä HDAC:n estäjien muissa kuin syöpäsairauksiin liittyvissä sovelluksissa, joita ovat esimerkiksi sydämen liikakasvun, astman ja erilaisten hermoston rappeutumishäiriöiden hoito.

3. Histonideasetylaasin estäjiä sisältävät yhdistelmähoidot

Vaikka niillä on omia syöpää ehkäiseviä vaikutuksia, yleisesti hyväksytään laajalti, että HDAC:n estäjät tehoavat tehokkaimmin käytettäessä niitä yhdistelmänä muiden syöpään liittyvien menetelmien kanssa. On olemassa lukuisia yhdistelmiä, joita parhaillaan arvioidaan prekliinisesti ja kliinisesti. Näitä ovat yhdistelmät metyylitransferaasin estäjien, kuten atsasitidiinin, reseptorivälitteisten sytotoksisten aineiden, kuten retinohapon, ja valohoidon kanssa. Etujen ja mahdollisten vaikeuksien korostamiseksi keskitytään tässä yhteydessä HDAC:n estäjien yhdistelmiin perinteisten antrasykliini-sytostaattihoitojen ja sädehoidon kanssa (kuva 3).

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 3

Molekyylireitit, jotka selittävät HDAC:n estäjien ja kemoterapian tai säteilyn yhdistelmien additiiviset ja/tai synergistiset vaikutukset. (a) Yksinkertaistettu kaavamainen esitys. Additiiviset ja/tai synergistiset sytotoksiset vaikutukset HDAC-inhibiittoreiden ja kemoterapeuttisten aineiden yhdistelmien käytön yhteydessä voivat olla seurausta histoniasetylaatiovälitteisistä muutoksista kromatiinin konformaatiossa sinänsä (erityisesti tapauksissa, joissa käytetään yhdistelmiä DNA:han kohdistuvien lääkkeiden, kuten antrasykliinien, kanssa, jotka edellyttävät pääsyä DNA:han). Vastaavasti HDAC:n estäjät voivat tehostaa ionisoivan säteilyn ja ultraviolettisäteilyn (UV-säteily) sytotoksisia vaikutuksia lisäämällä DNA:n vaurioitumiskykyä. Toinen mekanismi liittyy HDACi-välitteiseen geenien transkription säätelyyn – erityisesti Ku70-, Ku86-, DNA-PKcs- ja Rad51-geenien vähentyneeseen ilmentymiseen, sillä nämä geenit ovat kaksoissäikeiden katkeamisreittien keskeisiä komponentteja. Paradoksaalista kyllä, HDAC:n estäjien on osoitettu suojaavan ionisoivan säteilyn vaikutuksilta in vivo vähentämällä tulehdussytokiinien, kuten tuumorinekroositekijän, TNF-α:n ja fibrogeenisten kasvutekijöiden, kuten TGF-β1:n ja TGF-β2:n, ilmentymistä. (b) Trikostatiini A (TSA) lisää DNA:han kohdistettujen fototerapeuttisten aineiden (UVASens), ionisoivan säteilyn ja kemoterapeuttisten aineiden aiheuttamia DNA-vaurioita. Kuvassa esitetyssä esimerkissä DNA:n kaksoissäikeiden rikkoutuminen arvioitiin γH2AX-fokusten värjäyksellä. Soluja käsiteltiin 1 μM TSA:lla 24 tuntia ennen tunnin inkubointia 0,1 μM UVASensillä. Tämän jälkeen soluja säteilytettiin 10 J/m2 UVA:lla ja inkuboitiin vielä tunnin ajan ennen γH2AX-värjäystä. Asianmukaiset 10 J/m2- ja pelkät UVASens-kontrollit on myös kuvattu. Erillisissä kokeissa soluja käsiteltiin 1 μM TSA:lla 24 tuntia ennen 2 Gy:n (137Cs) säteilytystä. Solut värjättiin γH2AX-fokusten varalta tunnin kuluttua säteilytyksestä. Muissa kokeissa soluja käsiteltiin 1 μM TSA:lla 24 tuntia ennen tunnin inkubaatiota 1 μM doksorubisiinilla. Solut pestiin ja inkuboitiin vielä 24 tuntia ennen γH2AX-värjäystä.

Antrasykliinit, joita tyypillisesti ovat daunomysiini ja sen rakenteellinen analogi doksorubisiini, ovat etulinjan syöpäkemoterapeuttisia aineita, joiden kliininen historia ulottuu yli 50 vuoden päähän . Ne ovat tunnettuja DNA-interkalaattoreita ja topoisomeraasi II -entsyymin estäjiä. Antrasykliinien vaikutusmekanismeihin kuuluu RNA-synteesin estäminen, reaktiivisten happilajien muodostuminen ja DNA-vaurioiden kertyminen, mukaan lukien erityisen tappavat DNA:n kaksoissidekatkokset . Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että HDAC:n estäjät voivat tehostaa antrasykliinien sytotoksisia vaikutuksia. Esimerkiksi trikostatiini A:n on osoitettu lisäävän doksorubisiinin aiheuttamaa apoptoosia ja solukuolemaa ihmisen erytroleukemiallisissa K562-soluissa, anaplastisessa kilpirauhaskarsinoomassa ja A549-alveolaarisissa adenokarsinoomasoluissa . Samoin SAHA:n ja valproiinihapon on osoitettu lisäävän pahanlaatuisten solujen herkkyyttä doksorubisiinin vaikutuksille . HDAC:n estäjät indusoivat histonien hyperasetylaatiota, mikä johtaa avoimempaan, transkriptiota sallivaan kromatiinikonformaatioon, ja tämä ilmiö on todennettu MNaasi-digestiomäärityksillä . Lisäksi on osoitettu, että HDAC:n estäjät lisäävät asetyloituneessa kromatiinissa olevien antrasykliinien sitoutumiskohtien lukumäärää ja myös näiden kohtien affiniteettia . Näin ollen voidaan olettaa, että HDAC:n estäjät voivat lisätä antrasykliinin aiheuttamaa solukuolemaa ainakin osittain muuttamalla kromatiinin arkkitehtuuria. HDAC-inhibiittorien välittämät muutokset geeniekspressiossa ja muiden kuin histonisubstraattien toiminnan muuttuminen ovat kuitenkin myös mukana, kuten isomuodon-selektiivisillä inhibiittoreilla tehdyissä tutkimuksissa on tuotu esiin .

Additiivinen ja/tai synergistinen sytotoksinen vaikutus muodostaa perustan kliinisille tutkimuksille, joissa käytetään histonideasetylaasin estäjien ja antrasykliinien yhdistelmiä eri pahanlaatuisissa kasvaimissa . Mahdollisia komplikaatioita on kuitenkin havaittu. Esimerkiksi depsipeptidin on osoitettu säätelevän MDR1-geeniä leukemiasoluissa, mikä johtaa doksorubisiiniresistenssiin . MDR1:n koodaaman P-glykoproteiinipumpun ilmentymisen tiedetään johtavan monilääkeresistenssiin, joka on merkittävä kliininen ongelma onkologiassa, ja jatkotutkimukset ovat osoittaneet, että MDR1-geenin tukahduttaminen pahanlaatuisissa soluissa voidaan kumota erilaisilla HDAC-estäjillä . Toiset uudemmat tutkimukset ovat sitä vastoin osoittaneet, että HDAC:n estäjät saattavat tukahduttaa ABC-transportterien ilmentymistä, mikä korostaa, että tämä kysymys vaatii lisäselvityksiä .

Toinen mahdollinen komplikaatio HDAC:n estäjien käytössä on sydäntoksisuus. Tutkimukset ovat osoittaneet, että laajakirjoisilla HDAC:n estäjillä voi sinänsä olla kardiotoksinen aktiivisuus . Lisätutkimukset ovat osoittaneet, että esikäsittely HDAC-inhibiittoreilla voimistaa doksorubisiinin DNA:ta vahingoittavia ja sytotoksisia vaikutuksia soluviljelyjärjestelmissä . On hyvin tiedossa, että antrasykliinien annosta rajoittava sivuvaikutus on peruuttamaton sydäntoksisuus, joka johtuu reaktiivisten happilajien, kuten vahingollisten hydroksyyliradikaalien ja vetyperoksidin, muodostumisesta. Kardiomyosyytit ovat erityisen alttiita, koska niissä on muihin solutyyppeihin verrattuna suhteellisen vähän superoksidi-anionia ja vetyperoksidia detoksifioivia entsyymejä . Tutkimukset, joissa päätepisteinä käytettiin hypertrofisia vasteita ja DNA:n kaksoissidekatkosten induktiota, ovat osoittaneet, että laajakirjoiset HDAC:n estäjät, trikostatiini A, valproiinihappo ja natriumbutyraatti, lisäävät doksorubisiinin vaikutuksia . Vastaavasti in vivo -tutkimukset korostavat kiistoja HDAC:n estäjien biologiasta sydämessä. Esimerkiksi viimeaikaiset havainnot osoittavat, että trikostatiini A ja valproiinihappo suojaavat kuormituksen ja agonistin aiheuttamalta sydämen hypertrofialta in vivo . Vastakkaiset havainnot osoittavat kuitenkin, että Trichostatin A pahentaa rotilla keuhkovaltimon sidonnan aiheuttamaa oikean kammion toimintahäiriötä . Kun otetaan huomioon nämä mahdolliset komplikaatiot, selektiivisempien tai isoformispesifisempien HDAC:n estäjien yhdistelmävaikutukset tavanomaisten terapeuttisten aineiden kanssa voivat tarjota terapeuttista etua. Tässä yhteydessä hiljattain tehdyssä tutkimuksessa todettiin, että HDAC6-selektiivinen yhdiste, tubasiini, tehostaa doksorubisiinin ja etoposidin vaikutuksia transformoituneissa solulinjoissa . Tämänsuuntaisia lisäarviointeja odotetaan.

4. Histonideasetylaasin estäjien yhdistäminen sädehoitoon

Varhaiset tutkimukset osoittivat, että lyhytketjuinen rasvahappo, natriumbutyraatti, tehostaa paksusuolen ja nenänielun syöpäsolujen ionisoivan säteilyn sytotoksisia vaikutuksia . Vaikka vaikutuksen kuvaamiseen käytettiin epätavallista mekanismia, jatkotutkimus osoitti, että prototyyppinen HDAC:n estäjä, trikostatiini A, lisää myös pahanlaatuisten solujen säteilyherkkyyttä . Lisätutkimukset ovat vahvistaneet nämä havainnot ja osoittaneet, että käytännöllisesti katsoen kaikki laajakirjoiset HDAC:n estäjät, mukaan lukien trikostatiini A, SAHA, depsipeptidi, natriumbutyraatti, fenyylibutyraatti, tributyriini ja valproiinihappo, tehostavat säteilyn aiheuttamaa solukuolemaa pahanlaatuisissa soluissa . Suhteellisen suurilla HDAC-inhibiittoripitoisuuksilla on havaittu annosmuutoskertoimia (sellaisten HDAC-inhibiittorilla käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen säteilyannosten suhde, joilla saavutetaan sama eloonjäämisaste) ~2 . Näillä korkeammilla pitoisuuksilla HDAC-inhibiittoreiden aiheuttaman solusyklin pysähtymisen (G1 ja G2), DNA-synteesin estymisen ja apoptoosin indusoitumisen on arveltu selittävän säteilylle herkistävän vaikutuksen . Suhteellisen pienillä HDAC-inhibiittoripitoisuuksilla havaitaan myös säteilylle herkistävä vaikutus. Useissa tutkimuksissa on todettu yhteys HDAC:n eston ja DNA-vaurioon reagoiviin signaalikaskadeihin osallistuvien proteiinien välillä . Yhteenvetona voidaan todeta, että HDAC:n estäjien säteilylle herkistäviin vaikutuksiin voivat liittyä seuraavat mekanismit. Ensinnäkin histonien hyperasetylaatio muuttaa kromatiinin arkkitehtuuria, mikä johtaa avoimempaan kromatiinivahvistukseen, joka voi olla alttiimpi säteilyn aiheuttamalle alkuperäiselle DNA-vauriolle. Lisäksi HDAC:n estäjät voivat olla vuorovaikutuksessa keskeisten signaalinsiirtoproteiinien kanssa, jotka osallistuvat DNA-vauriovasteisiin. HDAC-inhibiittoreiden on lisäksi osoitettu säätelevän DNA:n kaksoissäikeiden katkeamisreitin korjaamiseen osallistuvien geenien transkriptiota. On esimerkiksi osoitettu, että SAHA:n esikäsittely heikentää säteilyn aiheuttamaa DNA:n korjausproteiinien Rad51 ja DNA-PKcs lisääntymistä. Vastaavasti natriumbutyraatin on osoitettu vähentävän DNA:n korjausproteiinien Ku70, Ku86 ja DNA-PKcs:n ilmentymistä melanoomasolulinjoissa . Lisäksi käyttämällä bleomysiiniä, doksorubisiinia ja etoposidia DNA:n kaksoissäikeiden katkeamisten indusoimiseksi γH2AX-pesäkkeiden kertymisen perusteella arvioituna on osoitettu, että histonideasetylaasi-inhibiittorit kohdistuvat Ku70:n asetylaatioon, mikä johtaa herkistymiseen .

Säteilyterapian kanssa tehtävissä kombinaatioissa valproiinihappo, jolla on pitkät kliiniset perinteet epilepsian hoidossa, on tärkeä . Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että HDAC-inhibiittori herkistää ihmisen glioomasolulinjoja ionisoivan säteilyn (röntgensäteilyn) vaikutuksille sekä in vitro että in vivo . Kuten äskettäin tarkasteltiin, valproiinihappoa on yhdistetty alkyloivaan aineeseen temotsolomidiin ja säteilyyn glioblastoma multiformen mahdolliseksi hoidoksi. Strategiaa arvioidaan parhaillaan vaiheen II kliinisessä tutkimuksessa .

5. Histonideasetylaasin estäjien säteilysuojavaikutus

Paradoksaalisesti uudet todisteet viittaavat siihen, että HDAC:n estäjillä on säteilysuojavaikutus. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että esikäsittely fenyylibutyraatilla tarjoaa vaatimattoman säteilysuojavaikutuksen ihmisen normaaleissa ja syöpäsoluissa . Lisätutkimukset osoittivat, että fenyylibutyraatti suojaa ihon säteilyoireyhtymältä in vivo . HDAC:n estäjien säteilysuojaavien ominaisuuksien uskotaan liittyvän tulehdussytokiinien (esim. interleukiini (IL-) 1, IL-8, tuumorinekroositekijä (TNF-)α) ja fibrogeenisten kasvutekijöiden (esim. transformoiva kasvutekijä (TGF-)β) tukahduttamiseen. Näiden tiedetään osallistuvan säteilyn aiheuttamaan tulehdusreaktioon, ja erityisesti TNF-α:n ja TGF-β:n pitkittynyt eritys epiteeli-, endoteeli- ja sidekudossoluista liittyy ihon säteilyoireyhtymään . Fenyylibutyraatin lisäksi laajakirjoisten HDAC:n estäjien trikostatiini A:n ja valproiinihapon on osoitettu suojaavan säteilyn aiheuttamilta ihovaurioilta ja säteilyn aiheuttamalta kuolleisuudelta hiirillä . Nämä vaikutukset korreloivat myös vähentyneen TNF-α-, TGF-β1- ja TGF-β2-ekspression kanssa . Tämänsuuntaiset lisätutkimukset fenyylibutyraatilla ovat osoittaneet, että HDAC:n estäjä voi suojata hiiriä akuutilta γ-säteilyn aiheuttamalta kuolleisuudelta. Vaikutukset korreloivat DNA-vaurioiden ja apoptoosin heikentymisen kanssa . Mielenkiintoista on, että fenyylibutyraatin ennaltaehkäisevä ja säteilyn jälkeinen anto tarjosi säteilysuojaa, mikä tarjoaa mielenkiintoisia kliinisiä sovellusmahdollisuuksia. Profylaksia olisi tarkoituksenmukaista sädehoidon yhteydessä ennen säteilyn altistumista, ja säteilyn jälkeinen anto olisi tarkoituksenmukaista tahattoman säteilyaltistuksen yhteydessä.

6. Johtopäätökset

HDAC:n estäjät ovat nousseet tärkeäksi uudeksi syöpälääkkeiden luokaksi. Vaikka niillä on yksinään voimakkaita sytotoksisia ja apoptoottisia vaikutuksia, on odotettavissa, että niistä on eniten hyötyä, kun niitä käytetään yhdessä muiden syöpähoitojen kanssa. Tämä näkyy suurimmassa osassa nykyisistä kliinisistä tutkimuksista, joissa HDAC:n estäjiä yhdistetään tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden ja sädehoidon kanssa. Tärkeä kysymys tällä alalla on edelleen se, onko luokkaselektiivisillä tai isoformispesifisillä yhdisteillä suurempi terapeuttinen teho kuin klassisilla laajakirjoisilla HDAC:n estäjillä. Laaja-alaisilla HDAC:n estäjillä on pleiotrooppisia syövänvastaisia vaikutuksia, mikä voi olla eduksi, kun otetaan huomioon pahanlaatuisten solujen heterogeenisuus ja sopeutumiskyky. Toisaalta luokka- tai isomuoto-selektiiviset yhdisteet voivat tarjota laajemman terapeuttisen ikkunan, jossa on vähemmän off-target-vaikutuksia. HDAC-entsyymien toiminnan ymmärtämiseen tähtäävä tutkimustoiminta on tällä hetkellä vilkasta, ja spesifisempiä yhdisteitä on yhä enemmän saatavilla. Siksi on odotettavissa, että selektiivisyyskysymys selkiytyy, mikä ehkä avaa uusia mahdollisuuksia tämän yhdisteryhmän kliiniseen käyttöön.

Conflict of Interests

Both K. Ververis and T. C. Karagiannis ilmoittavat, ettei heillä ole suoraa taloudellista suhdetta tässä artikkelissa mainittuihin kaupallisiin identiteetteihin, joka voisi johtaa eturistiriitaan.

Kiitokset

Australialaisen ydintieteen ja -tekniikan instituutin tuesta kiitetään. T. C. Karagiannis on saanut AINSE-palkintoja. Epigenomic Medicine Laboratory -laboratoriota tukee Australian kansallinen terveys- ja lääketieteellinen tutkimusneuvosto (National Health and Medical Research Council of Australia). K. Ververistä tukee Baker IDI:n jatkotutkintostipendi. Tätä artikkelia on osittain tuettu Victorian hallituksen Operational Infrastructure Support Program -ohjelmasta. Kirjoittajat haluavat kiittää Monash Micro Imagingin AMREP:ssä tarjoamien tilojen käytöstä ja erityisesti tohtoreiden Stephen Cody ja Iśka Carmichaelin asiantuntija-avusta.