Holliday-risteys

Homologisen rekombinaation kaksi reittiä eukaryooteissa, joissa näkyy Holliday-risteysten muodostuminen ja resoluutio

Holliday-risteys on keskeinen välietappi homologisessa rekombinaatiossa, biologisessa prosessissa, joka lisää geneettistä diversiteettiä siirtämällä geenejä kahdesta kromosomista toisiinsa, samoin kuin paikkaspesifisissä rekombinaatio-tapahtumissa, joissa on osallisena integraasia. Lisäksi ne osallistuvat kaksoisjuostekatkosten korjaamiseen. Lisäksi Holliday-kytkentöjä sisältäviä ristinmuotoisia rakenteita voi syntyä lievittämään kierteistä jännitystä symmetrisissä sekvensseissä DNA:n superkierteissä. Vaikka nelihaaraliitoksia esiintyy myös toiminnallisissa RNA-molekyyleissä, kuten U1-spliceosomaalisessa RNA:ssa ja tupakan rengaslaikkuviruksen hiusneulan ribotsyymissä, näissä on yleensä parittomia nukleotideja parillisten kaksoiskelikaalisten domeenien välissä, eivätkä ne näin ollen noudata tiukasti Holliday-rakennetta.

Homologisessa rekombinaatiossa Holliday-liitokset ovat identtisten tai melkein identtisten sekvenssien välissä, mikä johtaa sekvenssien symmetriseen sijoittumiseen keskimmäisen liitoskohdan ympäri. Tämä mahdollistaa haarojen siirtymisprosessin, jossa säikeet liikkuvat risteyskohdan läpi. Holliday-risteyksen pilkkoutuminen eli resoluutio voi tapahtua kahdella tavalla. Alkuperäisen säikejoukon pilkkominen johtaa kahteen molekyyliin, joissa voi esiintyä geenimuunnosta, mutta ei kromosomiristeytymistä, kun taas toisen kahden säikejoukon pilkkominen aiheuttaa sen, että tuloksena syntyvissä rekombinanttimolekyyleissä esiintyy risteytymistä. Kaikki tuotteet ovat pilkkomisesta riippumatta heteroduplekseja Holliday-liitoksen siirtymäalueella.

Monet proteiinit pystyvät tunnistamaan tai vääristämään Holliday-liitosrakennetta. Yksi tällainen luokka sisältää risteyksiä purkavia entsyymejä, jotka pilkkovat risteyksiä, joskus sekvenssispesifisesti. Tällaiset proteiinit vääristävät risteymän rakennetta eri tavoin, usein vetämällä risteymän pinoutumattomaan konformaatioon, rikkomalla keskeisiä emäspareja ja/tai muuttamalla neljän varren välisiä kulmia. Muita luokkia ovat haarojen siirtymäproteiinit, jotka lisäävät vaihtonopeutta kertaluokkaa, ja paikkaspesifiset rekombinaasit. Prokaryooteissa Holliday-liitoksen resolvaasit kuuluvat kahteen perheeseen, integraaseihin ja nukleaaseihin, jotka kumpikin ovat rakenteellisesti samankaltaisia, vaikka niiden sekvenssit eivät ole konservoituneita.

Eukaryooteissa kaksi ensisijaista mallia siitä, miten homologinen rekombinaatio korjaa DNA:n kaksoissäikeiden katkeamisia, ovat kaksoissäikeiden katkeamisten korjaamisreitti (double-strand break repair, DSBR-reitti) (jota kutsutaan joskus myös kaksinkertaisen Holliday-liitoksen malliksi) ja synteesistä riippuvainen säikeen annealing (synthesis-dependent strand annealing) -reitti (SDSA). Kaksoisjuostekatkoksen yhteydessä 3′-pää hajoaa ja pidempi 5′-pää tunkeutuu vierekkäiseen sisarkromatidiin muodostaen replikaatiokuplan. Kun tämä kupla lähestyy rikkoutunutta DNA:ta, pidempi 5′ antisense-juoste tunkeutuu jälleen tämän DNA-osan sense-juosteeseen ja transkriboi toisen kopion. Kun replikaatio päättyy, molemmat hännät yhdistyvät uudelleen muodostaen kaksi Holliday-liitosta, joita proteiinit sitten pilkkovat eri tavoin. Animaatio tästä prosessista on nähtävissä täällä.

Kaksisäikeiset DNA-katkokset korjataan bakteereissa homologisen rekombinaation RecBCD-reitillä. Katkokset, jotka tapahtuvat vain toisella kahdesta DNA-juosteesta, niin sanotut yksijuosteiset katkokset, ajatellaan korjattavan RecF-reitin avulla. Sekä RecBCD- että RecF-reitit sisältävät sarjan reaktioita, jotka tunnetaan haarojen siirtymisenä (branch migration), jossa yksittäiset DNA-juosteet vaihdetaan kahden risteytyneen duplex-DNA-molekyylin välillä, ja resoluutiona (resolution), jossa nämä kaksi risteytynyttä DNA-molekyyliä leikataan erilleen ja palautetaan normaaliin kaksisäikeiseen tilaansa. Homologista rekombinaatiota esiintyy useissa virusryhmissä. DNA-viruksissa, kuten herpesviruksissa, rekombinaatio tapahtuu break-and-rejoin-mekanismin avulla, kuten bakteereissa ja eukaryooteissa. Bakteereissa haarojen siirtymistä helpottavat RuvABC-kompleksi tai RecG-proteiini, molekyylimoottorit, jotka käyttävät ATP:n hydrolyysin energiaa liitoskohdan siirtämiseen. Tämän jälkeen risteys on purettava kahdeksi erilliseksi dupleksiksi, jolloin palautuu joko vanhempien konfiguraatio tai ristikkäiskonfiguraatio. Homologisen rekombinaation aikana resoluutio voi tapahtua joko horisontaalisesti tai vertikaalisesti, jolloin syntyy patch-tuotteita (jos ne ovat samassa orientaatiossa kaksoissäikeen katkeamisen korjauksen aikana) tai liitostuotteita (jos ne ovat eri orientaatiossa kaksoissäikeen katkeamisen korjauksen aikana). RuvA ja RuvB ovat haarojen siirtymisproteiineja, kun taas RuvC on risteymiä purkava entsyymi.

Rekombinaatiosta on todisteita joissakin RNA-viruksissa, erityisesti positiivisen sensorisen ssRNA:n viruksissa, kuten retroviruksissa, pikornaviruksissa ja koronaviruksissa. On kiistanalaista, esiintyykö homologista rekombinaatiota negatiivisen senssin ssRNA-viruksissa, kuten influenssassa.

ResolutionEdit

Kasvihiivan Saccharomyces cerevisiae -hiivassa Holliday-liitokset voidaan ratkaista neljällä eri reitillä, jotka vastaavat olennaisilta osin kaikesta Holliday-liitosten ratkaisusta in vivo. Reitti, joka tuottaa suurimman osan risteytyksistä S. cerevisiae -nuppuhiivassa ja mahdollisesti nisäkkäissä, sisältää proteiinit EXO1, MLH1-MLH3-heterodimeeri (nimeltään MutL gamma) ja SGS1 (Bloomin syndrooman helikaasin ortologi). MLH1-MLH3-heterodimeeri sitoutuu ensisijaisesti Holliday-liitoksiin. Se on endonukleaasi, joka tekee yksijuosteisia katkoksia superkierteiseen kaksoisjuosteiseen DNA:han. MLH1-MLH3-heterodimeeri edistää ristiinkytkentöjen muodostumista. Vaikka kolme muuta reittiä, joihin osallistuvat proteiinit MUS81-MMS4, SLX1 ja YEN1, voivat edistää Holliday-liitoksen resoluutiota in vivo, kaikkien kolmen nukleaasin puuttumisella on vain vähäinen vaikutus risteytystuotteiden muodostumiseen.

Sekä MLH3:n (pääväylä) että MMS4:n (sivuväylä) osalta deletoidut kaksoismutantit osoittivat dramaattisesti vähentynyttä risteytymistä villityyppiin verrattuna (6-17-kertaisesti); itiöiden elinkelpoisuus oli kuitenkin kohtuullisen korkea (62 %) ja kromosomaalinen disjunktio näytti enimmäkseen toimivan.

Vaikka MUS81 on osa vähäistä risteytymisreittiä orastavan hiivan, kasvien ja selkärankaisten meioosissa, alkueläimessä Tetrahymena thermophilassa MUS81 näyttää olevan osa olennaista, ellei jopa hallitsevaa risteytymisreittiä. MUS81-reitti näyttää olevan vallitseva ristiinkytkeytymisreitti myös fissiohiivassa Schizosaccharomyces pombe.

MSH4- ja MSH5-proteiinit muodostavat hetero-oligomeerisen rakenteen (heterodimeeri) hiivassa ja ihmisessä. Hiivassa Saccharomyces cerevisiae MSH4 ja MSH5 toimivat spesifisesti helpottaakseen homologisten kromosomien välistä ristiinkytkentää meioosin aikana. MSH4/MSH5-kompleksi sitoo ja stabiloi kaksinkertaisia Hollidayn liittymiä ja edistää niiden hajoamista crossover-tuotteiksi. S. cerevisiae -lajin MSH4-hypomorfinen (osittain toimiva) mutantti osoitti, että ristiinkytkentöjen määrä väheni 30 prosenttia koko genomissa ja että suuri määrä meiooseja, joissa ei ollut vaihtokromosomeja, oli suuri. Tästä huolimatta tämä mutantti synnytti itiöiden elinkelpoisuusmalleja, jotka viittaavat siihen, että ei-vaihtuvien kromosomien erottelu tapahtui tehokkaasti. Näin ollen S. cerevisiaessa asianmukainen segregaatio ei ilmeisesti ole täysin riippuvainen homologisten parien välisistä ristiinkytkennöistä.