Hemosyaniini

Erilaisten V-geeniperheiden järjestäytynyt ilmentyminen ja antigeenispesifisyyksien hankkiminen ontogeneesin aikana

Pioneeritutkimuksissa, Silverstein osoitti, että karitsojen vasteet tietyille antigeeneille, kuten viruksille, ferritiinille, atsoproteiineille, ovalbumiinille ja hemosyaniinille, voitiin saada sikiöaikana, kun taas vasteet kurkkumätä-toksoidille, O-antigeenille ja BCG:lle saatiin vasta 40 päivän kuluttua syntymän jälkeisestä elämästä. Tutkimukset vasta-ainevasteista ja idioottien ilmentymisestä nuorilla hiirillä ovat myös auttaneet osoittamaan, että kloonit aktivoituvat peräkkäin tai järjestyksessä syntymän jälkeisen elämän aikana. Eräät polysakkaridit, kuten β2-6-fruktosaani, S. tranaroa lipopolysakkaridi (LPS), jossa on α-metyyli-d-galaktosidin immunodominantti sokeri, tai β1-6-galaktaani, voivat saada aikaan immuunivasteen yhden päivän ikäisissä hiirissä. Immunisointi β2-6-fruktosaanilla ei johda A48- ja UPC10-ristireaktiivisen idiotyypin (IdX) lisääntyneeseen ilmentymiseen. Sitä vastoin noin 25 % LPS-spesifisistä vasta-aineista ilmentää Salmonella tranaroa LPS:lle spesifistä myeloomaproteiinia MOPC387 IdX. Vastaavasti 1 päivän ikäiset hiiret, jotka on immunisoitu gum ghatilla, kehittävät merkittävän antigalaktaanisen plakkia muodostavien solujen (PFC) vasteen, josta 30 % ilmentää X24-idiotyyppiä. Tutkimukset fosfokoliini- (PC), fenyyliarsonaatti- (Ars) ja trinitrofenyyli- (TNP) vasta-ainevasteiden ontogeneesistä ovat osoittaneet, että vasta-aineiden tuotanto näitä antigeenejä vastaan, joilla on sama spesifisyys kuin myeloomaproteiinien IdX:llä, voidaan indusoida 1 viikon ikäisillä hiirillä. Siten suurin osa T15 IdX:ää kantavista PC-spesifisistä esiasteista voidaan havaita 4-5 päivän kuluttua syntymästä, kun taas soluja, jotka kykenevät tuottamaan IdX+ Ars-spesifisiä vasta-aineita, esiintyy vastasyntyneillä hiirillä jo ennen 7. päivää. 1 päivän ikäisten hiirten immunisointi TNP-LPS:llä ja 1 viikon ikäisten hiirten immunisointi TNP-Ficollilla sai aikaan merkittävän TNP-vastaisen vasteen. DNP:tä sitovalle myeloomaproteiinille MOPC460 ilmaistu 460Id havaittiin kuitenkin vain 1 viikon ikäisillä hiirillä, jotka oli immunisoitu TNP-LPS:llä, ja 3 viikon ikäisillä hiirillä, jotka oli immunisoitu TNP-Ficollilla. 460Id+ anti-TNP-kloonien aktivoituminen 7 päivän ikäisillä hiirillä osui samaan aikaan iän kanssa, jolloin anti-TNP-vasteen monipuolistuminen tapahtuu. α1-3-dekstraanin tapauksessa, vaikka MOPC104Id:tä ilmentäviä esiasteita voidaan havaita ensimmäisen elinviikon aikana, J558IdX-esiasteita esiintyy vasta 15-22 päivää syntymän jälkeen, minkä jälkeen niistä tulee nopeasti hallitsevia. Lisäksi olemme havainneet huomattavan ontogeenisen viiveenβ2-1-fruktosaanin (inuliinin) vastaisissa vasteissa. IdX:ää kantavan inuliinin vastaisen vasteen merkittävää lisääntymistä on havaittu vasta 28 päivän ikäisillä hiirillä. Tämä viivästynyt vaste liittyy esiasteiden puutteeseen nuorissa eläimissä. Viivästynyt ontogeeninen vaste havaittiin myös α1-6-dekstraanin tapauksessa, ja se liittyy myös esiasteiden puuttumiseen. Fernandez ja Moller itse asiassa osoittivat, että anti-α1-6-dekstraanin esiasteet voidaan havaita vasta 1 kuukauden ikäisillä hiirillä.

Vähemmistö edellä käsitellyistä tiedoista koskee T-riippumattomia antigeenejä, joten viivästyneet ontogeeniset vasteet eivät johdu T-solujen kypsymättömyydestä. Joidenkin vasta-ainevasteiden peräkkäistä aktivoitumista ei voida katsoa johtuvan V-geenin uudelleenjärjestelyjen puuttumisesta nuorilla hiirillä. Vaikuttaa epätodennäköiseltä, että joidenkin vasteiden myöhäistä kypsymistä voitaisiin selittää esiasteiden sietokyvyllä nuorilla eläimillä. Myöhäisten anti-β2-1-fruktosaanivasteiden tapauksessa tolerogeenin olisi oltava pikemminkin inuliini kuin levan. Vasteen puute rajoittuu β2-1-fruktosaaniin eikä β2-1-fruktosaanisidokseen, ja molempia epitooppeja kantaa bakteerien levan, joka on ympäristöantigeeni. Todennäköisempi selitys on, että peräkkäinen aktivoituminen on hankittu antigeenistä riippumattomilla generatiivisilla mekanismeilla tai T-solujen vaikutuksesta. Tietyt tuntemattomat mekanismit voivat määrittää tietyn VH:Vκ-parin muodostumisajankohdan, joka voi olla kriittinen tiettyjä epitooppeja tunnistavien yhdistymiskohtien spesifisyyden kannalta.

Loppujen lopuksi tiettyä V-geenien joukkoa ilmentävien kloonien peräkkäistä aktivaatiota voivat ohjata sisäiset voimat, kuten antiidiotyyppiset vasta-aineet. Tätä ajatusta tukevat vahvasti Vakilin ja Kearneyn tiedot, jotka analysoidessaan sikiön maksasta tai vastasyntyneistä peräisin olevien hybridoomien tuottamien vasta-aineiden joidenkin tärkeimpien IdX-vasta-aineiden sitoutumispesifisyyttä havaitsivat, että suurella osalla (7 %) niistä oli anti-Id-aktiivisuutta.

Sekä hiirillä että ihmisillä on lukuisia VH- ja Vκ-perimägeenejä. Proteiinisekvenssihomologian perusteella VH- ja Vκ-alkulinjan geenit luokiteltiin useisiin alaryhmiin, ja nyt ne on DNA-homologian perusteella luokiteltu eri perheisiin. Perheeseen kuuluvat sukulinjageenit ryhmittyvät klustereihin, jotka ovat harvoin lomittain ja antavat järjestyksen kromosomissa 12 raskaalle ketjulle tai kromosomissa 6 Vκ kevyelle ketjulle.

V-geeniperheiden ilmentymisen analyysi Abelson-transformoiduissa B-alkuisten solujen pre-B-solulinjoissa on osoittanut 3′-perheiden suosivan käyttöä. Itse asiassa VH81X:ää, tämän geeniperheen D-proksimaalisinta jäsentä, on havaittu sekä pre-B-solutyypin hybridoomissa että sikiön maksasta valmistetuissa hybridoomissa. Sen sijaan erilaiset tulokset on saatu tutkimuksissa, joissa geeniperheen käyttöä tutkittiin 6-8 viikon ikäisistä BALB/c-hiiristä valmistetuissa ei-transformoituneissa pre-B-solulinjoissa. Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että kaikki koettimet hybridisoituivat havaittavalla intensiteetillä lepäävistä pre-B-soluista peräisin olevaan RNA:han. Nämä tiedot osoittavat, että kaikki VH-geeniperheet olivat transkriptiivisesti aktiivisia aikuisten hiirten lepäävissä pre-B-soluissa. Inkubaatio 7 päivän ajan dendriittisolujen ja mitogeenistimuloitujen T-lymfosyyttien kanssa aiheutti VH7183-perheen suuremman ilmentymisen, mikä viittaa siihen, että tämän perheen ilmentymistä säätelevät muut tekijät kuin ontogeneesi ja että se liittyy ehkä B-solulinjan erilaistumisen tiettyihin vaiheisiin. VH-geenien ei-sattumanvaraisen uudelleenjärjestäytymisen toiminnallinen merkitys on huomattava sikiön kehittyvän toiminnallisen B-solurepertuaarin kannalta.

Yancopoulos ja Alt ovat esittäneet hypoteesin, jonka mukaan VH-perheen hyödyntämisen sijainnista riippuvainen preferenssi pre-B-soluissa ja vastasyntyneen maksassa liittyy todennäköisesti rekombinaasien välittämään yksiulotteiseen seurantamekanismiin VDJ-liittymisen aikana eikä niinkään kolmiulotteisen diffuusion aikana tapahtuvaan törmäyksiin liittyvään dissosiatiiviseen liittymiseen. On olemassa tietoja, jotka osoittavat, että yhden perheen VH-geenit voidaan korvata toisen perheen VH-geeneillä nuorissa lymfosyyteissä. Vaikuttaa siltä, että V-geenien korvautuminen on melko harvinainen tapahtuma, mutta se voi kuitenkin edistää pre-B-solurepertuaarin muodostumista. Myös ihmisen sikiön B-soluissa on havaittu erittäin rajoitettua VH-geenisegmenttien käyttöä. Ihmisen VH-repertuaarin analyysi 130 raskauspäivän iässä on osoittanut tiettyjen JH-geenien (JH3, JH4 ja JH5) vinoutuneen käytön ja myös VH-geenin, jonka nimeksi on annettu 56P1 ja joka osoittaa suurta homologiaa hiiren VH81X:n kanssa, joka kuuluu VH7183-perheeseen ja joka on järjestäytynyt uudelleen etupäässä hiiren pre-B-soluissa.

Vastaavasti tietyt Vκ-perheet ekspressoituvat etupäässä ontogeneesin aikana. Kaushik ja kollegat analysoivat Vκ-perheiden käyttöä vastasyntyneiden hiirten B-soluissa käyttäen LPS:n indusoimaa B-solujen pesäkemääritystä. Tulokset osoittavat, että vastasyntyneiden C57BL/6-hiirten solut käyttävät erittäin paljon Vκ-perheitä, kuten Vκ1:tä, Vκ9:ää ja Vκ8:aa, jotka sijaitsevat Vκ-lokuksen keskellä. Mielenkiintoista on, että Jκ-läheisimmän Vκ-perheen, Vκ21:n, ilmentymistä ei havaittu vastasyntyneiden B-solujen pesäkkeissä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Vκ:n käyttö vastasyntyneillä hiirillä ei heijasta 3′-perheiden ekspressiota, vaan pikemminkin Vκ1- ja Vκ9-perheiden, jotka sijaitsevat Vκ-paikannuksen keskellä, ensisijaista käyttöä. Erot viittaavat siihen, että Vκ-geenin uudelleenjärjestäytymisen ja ilmentymisen mekanismit eroavat VH-lokusta ohjaavista mekanismeista.