Guanidiini

Kalvoproteiinit

Guanidiini- ja SDS-liuokset ovat denaturoivia liuottimia, mutta halusimme luonnollisesti karakterisoida myös kalvoproteiinien natiivitilat. Vaikeutena tässä oli se, että vielä ei ollut yksimielisyyttä siitä, miten natiivitila tulisi määritellä tai käsittää – mikä meidän kaltaisillemme tulokkaille merkitsi epävarmuutta, koska meillä ei ollut sellaista kokemusta, jonka avulla olisimme voineet tehdä tarkkanäköisiä arvauksia siitä, mikä kilpailevista ajatuksista todennäköisesti osoittautuisi oikeaksi.

Jopa fosfolipidikaksoiskerroksesta, ainoasta välttämättömästä käsitteestä solukalvojen vähäisimmänkin ymmärryksen saavuttamiseksi, kiisteltiin yhä, vaikka se oli osoitettu ensimmäisen kerran punasoluissa lähes 50 vuotta aikaisemmin ja vaikka se oli termodynamiikan perusteella oikeastaan ainoa ajateltavissa oleva järjestely, mikä oli suora seuraus Irving Langmuirin klassisista mittauksista, joita hän teki vuonna 1917 amfifiilisten aineiden monokerroksilla. Olen kuvannut sitä, miten naurettavan hitaasti kaksoiskerroskonsepti hyväksyttiin tuona aikana kirjassani Ben Franklin Stilled the Waves . Tässä on kyse siitä, että skeptisyys säilyi edelleen, kun ryhdyimme mukaan kalvotutkimukseen.

Ja niiden keskuudessa, jotka olivat vakuuttuneita lipidikaksoiskerroksesta, proteiinien sisällyttämistapa kalvoihin oli edelleen avoin keskusteluille. Jotkut, kuten Duke-kollegamme David Robertson, eivät halunneet uskoa, että proteiinit voisivat todella läpäistä tai läpäistä kaksoiskerroksen. Kuvassa 3 esitetään kaksi varsin erilaista käsitteellistä kuvaa, jotka on otettu New Yorkin tiedeakatemian konferenssista vuonna 1972. Toinen on Robertsonin ”yksikkökalvo”, jossa proteiini on kokonaan ulkopuolella. Toinen on Vanderkooin näkemys sytokromioksidaasikomplekseista mitokondrioiden kalvoissa: proteiini on sijoitettu realistisemmin, mutta vielä ei ole mitään käsitystä erillisistä hydrofiilisistä ja hydrofobisista alueista ja siitä, miten ne sanelevat proteiinin ja lipidin vuorovaikutuksen. Myöhemmin samana vuonna 1972 Singerin ja Nicolsonin ”nestemäinen mosaiikkimalli” (fluid mosaic) popularisoi vihdoin Singerin ja Nicolsonin ”nestemäisen mosaiikin” mallin avulla nyt jo tavanomaiseksi muodostuneen idealisoidun kuvan fosfolipidikaksoiskalvoista, joissa toimivat proteiinit kulkevat koko matkan läpi.

Kuva 3. Singerin ja Nicolsonin malli. Kaksi toisistaan poikkeavaa käsitteellistä kuvaa kalvoproteiineista, jotka molemmat ehdotettiin samassa kokouksessa New Yorkissa vuonna 1972 : (a) Robertson ajatteli, että proteiinit olisivat epäsymmetrisesti sijoittuneet kahden kaksoiskerrospinnan ulkopuolelle; (b) Vanderkooin näkemys sytokromioksidaasikomplekseista poikkileikkauksessa.

Laboratoriossa nämä olivat jännittäviä aikoja, jännittävimpiä, joita voin muistaa. Opimme käyttämään hyvänlaatuisia detergenttejä, jotka, toisin kuin SDS, pystyivät liuottamaan kalvoproteiineja ilman karkeaa denaturoitumista, natiivia tilaa simuloivassa ympäristössä, mutta ympäristössä, jossa ne olisivat myös helposti saatavilla molekyylitason karakterisointia varten – edistysaskel, jossa meitä oli osittain ennakoinut kaksi sympaattista nuorta miestä Suomesta, Kai Simons ja Ari Helenius .

Käytännössä tyydyimme edelleen enimmäkseen mittaamaan molekyylipainoa ja kysymään, montako polypeptidiketjua molekyyliä kohti on, mutta proteiinit, joita nämä kysymykset koskivat, oli erotettu detergenttikäsittelyllä muista kalvokomponenteista. Mikä tärkeintä, monilla proteiineilla oli tunnettuja solutoimintoja, ja mittauksillamme oli merkitystä näiden toimintojen kannalta. Olen jo maininnut punasolut, mutta onnistuimme itse asiassa käsittelemään monenlaisia biologisesti merkityksellisiä aiheita, mihin monissa tapauksissa opiskelijoiden lähetystyön innokkuus kannusti meitä. Esimerkiksi fysiologian jatko-opiskelija Stuart Grefrath, joka oli kiinnostunut neurofysiologiasta, tuli laboratorioomme luettelemaan herätettävän kalvon polypeptidiketjuja – tässä tapauksessa valkoselkätikan hajuhermosta – ja tämä johti meidät myöhempään osallistumiseen useiden muiden aktiivisten kuljetusjärjestelmien kanssa. (Stuart itse valitettavasti kuoli synnynnäisen sydän- ja verisuonisairauden seurauksena ennen kuin hän pystyi toteuttamaan varhaisen lupauksensa itsenäisellä uralla). Aivomyeliini oli toinen hermostosta peräisin oleva kalvo, jota tarkastelimme .

Edelleen kannattaa mainita kaksi laboratoriossa vieraillutta henkilöä, jotka päättivät työskennellä yhdessä: Neal Robinson, postdoctoral fellow, ja Leon Visser, joka oli sapattivapaalla CSIR:stä Pretoriassa, Etelä-Afrikassa). He tekivät erittäin siistiä työtä määrittäessään kvantitatiivisesti sytokromi b5:n domeenirakenteen, joka on eräänlainen prototyyppi sen havainnollistamiseksi, miten kalvoproteiinit kiinnittyvät kalvoihin ja suorittavat silti tehtäväänsä viereisessä sytoplasmassa.

Muissa hankkeissa vastasimme kaukana asuvien kollegojen pyyntöihin. Olen jo maininnut Arthur Karlinin kanssa tehdyn työn sähkökalan asetyylikoliinireseptorista. Toinen esimerkki oli bakteriorodopsiini, jonka osalta teimme mittauksia detergenttiliuoksessa Kalifornian yliopiston Walter Stoeckeniuksen kehotuksesta . Tässä oli tärkeä kysymys, joka liittyi tämän proteiinin protonipumppausmekanismiin: onko natiiviproteiini toiminnallisesti monomeeri vai (kuten jotkut tiedot näyttivät viittaavan) trimeeri? Liuotettu proteiinimme oli kiistatta monomeeri, ja spektriset todisteet viittasivat siihen, että se kävi läpi saman molekyylimuutosten syklin kuin natiivissa kalvossa.

Useimmissa tapauksissa emme itse suoraan osallistuneet yrittäessämme arvuutella reseptoreiden tai pumppujen tai kanavien toimintaa, mutta tulimme väistämättä tietoisiksi siitä, mitkä olivat ongelmat. Se oli todella rikastuttava kokemus, aivan eri asia kuin silloin, kun seerumin albumiini ja β-laktoglobuliini (joita saatiin kaupallisilta toimittajilta) olivat tutkimuksemme ensisijaisia kohteita.

Ionipumppujen tapauksessa pääsimme itse asiassa mukaan fysiologiaan, enimmäkseen hypoteesin tai teorian tasolla; opettelimme mallintamaan kineettisiä skeemoja tietokoneella; osallistuimme asiaankuuluviin konferensseihin jne. Viimeinen sapattivapaamme – Max Planck -instituuttiin Heidelbergiin – oli tässä suhteessa tärkeä. Duken fysiologian osaston puheenjohtaja Ted Johnson liittyi meihin tällä kertaa, joten meitä oli kolme aktiivisessa yhteistyössä. Ted oli ollut tietokoneharrastaja jo pitkään, ja hän oli liittänyt kaikki fysiologian tiedekunnan jäsenet North Carolina Research Trianglen keskitettyyn tietokonelaitteistoon ennen kuin tuli muodikkaaksi käyttää laitoksen varoja tähän tarkoitukseen. Noihin aikoihin meidän oli kirjoitettava omat ohjelmamme tietokoneelle, mikä oli minulle vaikeaa, mutta uskon, että saimme joitakin hyödyllisiä tuloksia, enimmäkseen kineettisistä malleista ATP-vetoisen Na,K-pumpun pumppausjaksolle. Työskentelimme epäsovinnaisia työaikoja, myös viikonloppuisin ja juhlapyhinä, mikä oli toisinaan epämiellyttävää Heidelbergin isännillemme, jotka olivat tottuneet sulkemaan keskuslämmityksen pois päältä, kun laboratorion oli tarkoitus olla tyhjillään. Noin joka kymmenes päivä ajoimme rajan yli Strasbourgiin gourmet-lounaalle – mukana oli alsacelaisia viinejä, joiden mausta olemme nauttineet siitä lähtien.