Geelifiltraatiokromatografia

Gelifiltraatiokromatografian sovellukset

Gelifiltraatiokromatografiaa, joka on eräänlainen koon poissulkemiskromatografia, voidaan käyttää joko näytteessä olevien molekyylien ja kompleksien fraktioimiseen fraktioiksi, jotka ovat tietyn kokoluokan fraktioita, tai kaikkien tiettyä kokoluokkaa suurempien molekyylien poistamiseen näytteestä, tai molempien toimintojen yhdistelmää. Geelisuodatuskromatografiaa voidaan käyttää pienten molekyylien, proteiinien, proteiinikompleksien, polysakkaridien ja nukleiinihappojen kaltaisten yhdisteiden erottamiseen vesiliuoksessa. Kun liikkuvana faasina käytetään orgaanista liuotinta, prosessia kutsutaan geelipermeaatiokromatografiaksi.

Geelisuodatuskromatografiaa voidaan käyttää myös:

• Molekyylien ja kompleksien fraktiointiin ennalta määrätyllä kokoalueella
• Kokoanalyysiin ja -määritykseen
• Suurten proteiinien ja kompleksien poistamiseen
• Puskurinvaihtoon
• Suolanpoistoon
• Pienten molekyylien, kuten nukleotidien, alukkeiden, väriaineiden, poistamiseen, ja epäpuhtaudet
• Näytteen puhtauden arviointi
• Sitoutuneiden ja sitoutumattomien radioisotooppien erottaminen

Geelisuodatuskromatografia-aineita kaikkiin edellä mainittuihin käyttötarkoituksiin on saatavana valmiiksi pakattuina painovoimaisina virtauskolonneina, pyörityskolonneina, matala- ja keskipaine- ja keskipainekromatografiakolonneina sekä pullotettuina hartseina.

Gelinsuodatuskromatografian mekanismi

Gelinsuodatuskromatografiakolonnissa stationäärifaasi koostuu huokoisesta matriisista, ja liikkuva faasi on puskuri, joka virtaa matriisihelmien välissä. Helmillä on määritelty huokoskokoalue, jota kutsutaan fraktiointialueeksi. Molekyylit ja kompleksit, jotka ovat liian suuria tunkeutuakseen huokosiin, pysyvät liikkuvassa faasissa ja liikkuvat kolonnin läpi puskurivirtauksen mukana. Pienemmät molekyylit ja kompleksit, jotka pystyvät siirtymään huokosiin, siirtyvät stationäärifaasiin ja liikkuvat geelisuodatuskolonnin läpi pidempää reittiä helmien huokosten läpi.

Mikä tahansa molekyyli tai kompleksi, joka on tietyn geelisuodatuskromatografiakolonnin fraktioitumisalueen yläpuolella, liikkuu kolonnin läpi nopeammin kuin mikä tahansa muu, joka pystyy siirtymään stationäärifaasiin. Näin ollen kaikki näytteen ainesosat, jotka ovat fraktiointialueen yläpuolella, eluoituvat ensin (tyhjään tilavuuteen) ennen kaikkea, mikä on fraktiointialueella. Pienintä kokoa, joka jää liikkuvaan faasiin eikä pääse stationäärifaasiin, kutsutaan poissulkemisrajaksi. Bio-Rad tarjoaa geelisuodatuskromatografia-aineita ja -kolonneja, joiden poissulkemisrajat vaihtelevat yli kolmen suuruusluokan välillä, 100 daltonista 100 000 daltoniin (100 kDa).

Molekyylit ja kompleksit, jotka voivat päästä stationäärifaasiin, fraktioituvat kokonsa mukaan. Pienemmät molekyylit siirtyvät syvälle huokosiin ja hidastuvat enemmän kuin suuremmat molekyylit, jotka eivät pääse niin helposti huokosiin ja eluoituvat näin ollen kolonnista nopeammin. Tämä huokosvaelluksen ero johtaa komponenttien fraktioitumiseen koon mukaan siten, että suurimmat eluoituvat ensin.

Suolanpoistoon, puskurinvaihtoon ja pienten molekyylien, kuten nukleotidien, poistoon suunnitelluissa geelisuodatuskromatografiakolonneissa suolat ja pienet yhdisteet pääsevät helposti huokosiin, hidastuvat ja vaeltavat hitaammin kolonnin läpi kuin suuremmat valkuaisaineet tai nukleiinihapot. Näin ollen näytteen kiinnostavat komponentit eluoituvat ennen suoloja, nukleotideja jne. Tätä mekanismia käyttävät DNA-puhdistussarjat sisältävät usein geelisuodatuksen spin-kolonnia.

Resoluutio, joka määritellään tässä kokofraktioiden välisten rajojen terävyydeksi, määräytyy helmien koon ja useiden muiden tekijöiden mukaan. Pienemmällä helmikoolla saadaan yleensä korkeampi resoluutio geelisuodatuskromatografiakolonnissa. Kompaktit molekyylit diffundoituvat stationäärifaasin läpi nopeammin kuin lineaariset molekyylit. Puskurin koostumus, ionivahvuus ja pH vaikuttavat kokoerotukseen, fraktiointialueeseen ja eluointinopeuteen. Monimutkaisten proteiiniseosten fraktioinnissa eluutioajat ja kokopoissulkeutumisrajat saatetaan joutua määrittämään empiirisesti.

Gelinsuodatuskromatografian väliaineet

Tärkeä kriteeri geelinsuodatuskromatografian väliaineille on se, että väliaine on inertti eikä mikään näytteessä tai missään puskurissa olevalla aineella sitoudu väliaineeseen. Toinen näkökohta on käytettävän geelisuodatuskolonnin tyyppi ja se, käytetäänkö sitä paineistetussa kromatografiajärjestelmässä vai painovirtaus- tai spin-kolonnissa. Jos käytetään paineistettua kromatografiajärjestelmää, sekä kolonnin että väliaineen on kestettävä käytetty paine ja virtausnopeus.

Yleisesti käytetyt väliaineet geelisuodatuskromatografiassa perustuvat agaroosi- tai polyakryyliamidihelmiin, dekstroosiin painovoima- tai matalapainejärjestelmissä ja polymeerihartseihin keskipainejärjestelmissä. Väliaineen valinta riippuu erotettavien komponenttien ominaisuuksista ja muista kokeellisista tekijöistä. Seuraavassa esitetään yleisiä näkökohtia geelisuodatuskromatografia-aineksen valintaa määritettäessä:

• Fraktioalue
• Koon poissulkemisraja
• Käyttöpaine
• Virtausnopeus
• Näytteen viskositeetti
• pH-alue
• Autoklavoituvuus
• Sietokyky veteen sekoittuvien orgaanisten liuottimien suhteen; jotkin näytteet voivat olla paremmin liukenevia vesi-orgaaniseen seokseen
• Toleranssi pesuaineille, kaotrooppisille aineille, formamidille jne.
• Toimintalämpötila

Näytetyypit, väliaineen valinta ja kromatografiajärjestelmän asetukset määräävät, mitkä parametrit ovat tärkeimpiä tietyssä puhdistussovelluksessa.