Gamma-glutamyylitranspeptidaasi

Aktiivisuus ja spesifisyys

Siten tämän entsyymin katalysoima reaktio ymmärretään yleisesti γ-glutamyyliryhmän siirtymiseksi erilaisiin akseptorimolekyyleihin, kuten veteen, aminohappoihin, dipeptideihin ja γ-glutamyylidonoriin itseensä, reaktio-olosuhteista riippuen. Nämä katalyyttiset ominaisuudet liittyvät GGT:n katalyyttiseen mekanismiin, jossa reaktio etenee asylaatio-deasylaatio-kaksoissiirtymismekanismilla γ-glutamyylientsyymin välituotteen välityksellä.

Kuten luonnollisen substraatin glutationin ja sen johdannaisten rakenteiden perusteella on odotettavissa, GGT tunnistaa tiukasti γ-glutamyyliosan, mutta sillä on melko laaja substraattispesifisyys lähtevän ryhmän (Xaa) suhteen. Glutationi, sen S-konjugaatit, glutationidisulfidi, γ-glutamyylidi- tai tripeptidit, glutamiini, γ-glutamyyliamidien l-α-metyylijohdannaiset, leukotrieeni C4, poly-γ-glutamyylijohdannaiset hyväksytään kaikki substraateiksi. Keinotekoiset substraatit, kuten l-γ-glutamyyli-p-nitroanilidi (l-γ-Glu-pNA) ja fluoresoiva l-γ-glutamyyli-7-amino-4-metyylikumariini (l-γ-Glu-AMC), ovat aktiivisia substraatteja, joita käytetään yleisesti γ-glutamyyliakseptorien läsnäollessa tai poissaollessa (ks. jäljempänä) transpeptidaasi- tai hydrolaasimäärityksessä.

Substraattispesifisyyttä akseptorin suhteen on tutkittu laajimmin rotan munuaisten GGT:llä . Neutraalien aminohappojen, kuten l-kystiinin, l-Gln:n, l-Met:n, l-Ala:n, l-Cys:n ja l-Ser:n, l-isomeerit ovat hyviä akseptoreita, mutta hydrofobiset ja haaraketjuiset aminohapot, kuten l-Phe:n, l-Trp:n, l-Leu:n, l-Ile:n ja l-Val:in kaltaiset hydrofobiset ja haaraketjuiset aminohapot, ovat melko huonoja substraatteja. d-aminohapot ja α:lla substituutioidut aminohapot eivät toimi akseptoivina substraatteina. Siksi d-γ-Glu-pNA:n käyttö on kätevä tapa estää autotranspeptidaatio mitattaessa hydrolaasiaktiivisuutta. Koska akseptorin sitoutumiskohta on päällekkäinen glutationin Cys-Gly-osan osa-alueiden kanssa, entsyymi suosii akseptorisubstraatteina akseptorisubstraatteina suhteellisen aktiivisuuden mukaan laskevassa järjestyksessä dipeptidejä, joiden C-terminaalissa on Gly, kuten l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-kystinyyli-bis-Gly, Gly-Gly ja l-Ser-Gly . Peptidit, joissa on enemmän kuin kaksi aminohappojäännöstä, ovat erittäin huonoja akseptoreita. Akseptorina toimivien aminohappojen ja dipeptidien Km-arvot ovat suhteellisen korkeita ja sijoittuvat välille 0,1-5 mM , mutta Gly-Gly (Km=3 mM) on sopivin transpeptidaasiaktiivisuuden akseptorisubstraatti. Akseptorimolekyylien suuret pitoisuudet estävät GGT:tä kilpailevasti γ-glutamyylidonoriin (γ-Glu-Xaa) nähden, mikä johtuu todennäköisesti Xaa:n ja akseptorin sitoutumiskohtien päällekkäisyydestä. Substraattispesifisyys Cys-alapaikan suhteen riippuu entsyymin alkuperästä; esimerkiksi E. coli -entsyymi suosii tässä paikassa emäksisiä aminohappoja (l-Arg, l-Lys ja l-His) ja aromaattisia aminohappoja (l-Phe, l-Trp ja l-DOPA). Akseptorispesifisyyteen on kuitenkin suhtauduttava varovaisesti, koska näennäinen aktiivisuus riippuu myös kyseisessä pH:ssa käytettävissä olevan deprotonoidun aminohapon efektiivisestä pitoisuudesta. Gly-Glyllä havaittu suhteellisen korkea aktiivisuus johtuu osittain tämän dipeptidin alhaisesta pKa:sta . Akseptorisubstraattien deprotonoidut aminoryhmät näyttävät olevan välttämättömiä transpeptidaatiolle.

Yleisimmin käytetty entsyymimäärityksessä käytetty luovuttajasubstraatti on l-γ-Glu-pNA. Tyypillinen määritysseos rotan munuaisten entsyymin transpeptidaasiaktiivisuudelle koostuu 5 mM l-γ-Glu-pNA:sta, 100 mM Gly-Glystä 0,1 M Tris-HCl:ssä (pH 8,0) 25 °C:ssa. Riittävän Gly-Gly-konsentraation lisääminen estää tehokkaasti hydrolyysin ja autotranspeptidaation. GGT:n optimaalinen pH on noin 7,5-9 transpeptidaatiolle, mutta pH-riippuvuus on paljon pienempi hydrolyysille . Tämä on sopusoinnussa sen kanssa, että näennäinen transpeptidaasiaktiivisuus on osittain riippuvainen akseptorien vapaan aminoryhmän tehollisesta konsentraatiosta .

Hydrolaasiaktiivisuus glutamiinille kasvaa jopa 12-kertaiseksi lisäämällä akseptoripaikalle suunnattuja modulaattoreita, kuten maleaattia, hippuraattia ja glykokokolaattia. Näiden yhdisteiden lisääminen estää akseptorisubstraattien ja Cys-Gly-alasiittejä miehittävien γ-glutamyylidonorien sitoutumista. γ-glutamyylidonoreiden lisääminen tai inhibiittoreiden sitoutuminen γ-glutamyylidonorikohtaan lisää näiden modulaattoreiden affiniteettia, mikä viittaa yhteistyövuorovaikutukseen γ-glutamyylidonoreiden ja akseptoreiden sitoutumiskohtien välillä (ks. katsaus Tate & Meister ). Näiden modulaattoreiden miehittämän akseptoripaikan ehdotetaan edistävän GGT:n konformaatiomuutosta aktiiviseen muotoon, mikä helpottaa siirtymätilan muodostumista. Tämän ehdotetaan myös selittävän nisäkäsentsyymien inaktivoitumisnopeuden lisääntymistä akivisiinin vaikutuksesta (vide infra), mutta tätä ei havaittu γ-monofluorofosfonaatin, aktiiviseen kohtaan suuntautuvan siirtymätilan analogisen affiniteettimerkin, eston yhteydessä . Akivisiini näyttää sitoutuvan muuhun nukleofiiliseen jäännökseen kuin nisäkkäiden GGT:n katalyyttiseen nukleofiiliin .

GGT:tä inhiboi reversiibelisti ja kompetitiivisesti l- ja d-γ-glutamyyli-(o-karboksi)fenyylihydrazidi (antglutiini, jota tuottaa Penicillium oxalicum) Ki:n ollessa 8 μM, eikä akuuttia myrkyllisyyttä ole raportoitu hiirille . Useat glutamaattianalogit, joilla on reaktiivinen ryhmä γ-karboksin lähellä, toimivat palautumattomina estäjinä. 6-diatso-5-okso-l-norleusiini (DON), O-diatsoasetyyli-l-seriini (l-atsaseriini) ja l-(αS,5S)-α-amino-3-kloori-4,5-dihydro-5-isoksatsolietikkahappo (akivisiini tai AT-125, jota tuottaa Streptomyces sviceus) ovat voimakkaita mutta epäspesifisiä GGT:n inaktivaattoreita . Akivisiinia on käytetty laajalti GGT:n aktiivisuuden tukahduttamiseen in vivo , vaikka akivisiini on erittäin myrkyllinen, koska se inaktivoi useita glutamiini-amidotransferaaseja, jotka osallistuvat nukleotidien, aminohappojen ja aminosokerien biosynteesiin . Seriiniboraattikompleksi sitoutuu palautuvasti γ-glutamyylin sitoutumiskohtaan ja estää GGT:tä Ki:n ollessa 20 μM . Tämä klassinen havainto on johtanut voimakkaaseen ja hitaasti sitoutuvaan inhibiittoriin, l-2-amino-3-booronobutaanihappoon (γ-boroGlu) . GGT:tä estetään kokonais-Ki:llä, joka on 17 tai 35 nM, mutta esto on kuitenkin palautuva. 2-Amino-4-(fluorofospono)butaanihappo (γ-PFGlu), glutamaattianalogi, jonka γ-karboksi on korvattu elektrofiilisellä fosforilla, on tehokas mekanismiin perustuva ja aktiiviseen kohtaan kohdistuva E. coli GGT:n affiniteettimerkintäaine. Tämä yhdiste inhiboi GGT:tä nopeasti ja palautumattomasti muodostaen stabiilin, anionisen ja tetraedrisen siirtymätilan kaltaisen adduktin, joka soveltuu peptidikartoitukseen E. coli GGT:n katalyyttisen nukleofiilin tunnistamiseksi (ks. jäljempänä). Sarja γ-(monofenyyli)fosfono- ja γ-fosfonodiesteriglutamaattianalogeja toimii mekanismiin perustuvina inhibiittoreina, jotka estävät GGT:tä irreversiibelisti sen katalyyttisen nukleofiilin kovalenttisen modifioinnin avulla. Erityisesti γ-fosfonodiesterit, jotka sisältävät Cys-Gly:n ja sen C-terminaalisen karboksiryhmän rakenteellista jäljitelmää, ovat poikkeuksellisen aktiivisia ihmisen GGT:hen nähden, ja niiden inaktivoitumisnopeus on 130-6000 kertaa nopeampi kuin akivisiinin. Inhibitio on selektiivinen GGT:lle, eikä myrkyllisyyttä ole havaittu. Yksi näistä inhibiittoreista on kaupallisesti saatavilla nimellä ”GGsTop” (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Miehen GGT:n ei-glutamaattianaloginen inhibiittori on löydetty korkean läpimenon seulonnalla . Tämä yhdiste miehittää γ-glutamyylisubstraattikompleksin akseptorikohdan Ki:n ollessa 17,6 μM. Inhibiittori on lajiselektiivinen, mutta se on palautuva, ja jonkin verran myrkyllisyyttä on raportoitu.

GGT:n katalysoiman reaktion ajatellaan etenevän ping-pong-mekanismilla γ-glutamyyli-entsyymin välituotteen kautta, kuten seriinihydrolaaseilla on havaittu . Pienen alayksikön N-terminaalinen Thr Oγ on katalyyttinen nukleofiili, johon γ-glutamyyliryhmä on kiinnittynyt (ks. rakennekemia). GGT:n katalyyttinen nukleofiili tunnistettiin ensimmäistä kertaa E. coli GGT:stä pienen alayksikön N-terminaaliseksi Thr-jäännökseksi (Thr391) γ-PFGlu:lla inaktivoidun entsyymin peptidikartoituksen avulla. Tämä jäännös, joka vastaa Thr380:aa (rotan munuaisentsyymi) ja Thr381:tä (ihmisen entsyymi), on konservoitunut kaikissa GGT:issä, joiden primaarisekvenssit tunnetaan. Ihmisen GGT:n katalyyttinen nukleofiili on tunnistettu Thr381:ksi γ-(monofenyyli)fosfonaffiniteettimerkillä inaktivoidun entsyymin peptidikartoituksessa . GGT:n katalysoima reaktio alkaa siis pienen alayksikön N-terminaalisen Thr-jäännöksen nukleofiilisellä hyökkäyksellä luovuttajasubstraatin (γ-Glu-Xaa) γ-karboksyyliin Xaa:n poistamiseksi. Näin muodostunut γ-glutamyylientsyymi reagoi veden kanssa (hydrolyysi) tai aminohappojen ja dipeptidien kanssa (transpeptidaatio ja autotranspeptidaatio) nopeuden määräävässä vaiheessa .

GGT kuuluu N-terminaalisiin nukleofiilihydrolaaseihin (Ntn-hydrolaaseihin), kuten ennustetaan sen ainutlaatuisen poimun ja kypsymisprosessin perusteella, jossa aktiivinen kypsän entsyymin dimeerimuoto syntyy posttranslationaalisen autokatalyyttisen prosessoinnin avulla katalyyttisesti inaktiivisesta esiasteesta. Tämä on vahvistettu paikkaohjatulla mutageneesillä ja bakteerientsyymien röntgenrakenneanalyysillä (ks. Rakennekemia).