Frontiers in Pharmacology

Introduction

Yleisimpään dementiatyyppiin, Alzheimerin tautiin (Alzheimerin tauti, AD), liittyy kognitiivisten toimintojen krooninen heikkeneminen, ja sen osuus dementiatapauksista on 60-70 % (Fan ja Chiu, 2014; Lu et al., 2018). Vuonna 2014 tehdyn katsauksen mukaan noin 35,6 miljoonaa ihmistä sairastaa tällä hetkellä Alzheimerin tautia, ja Alzheimerin taudin esiintyvyys lisääntyy asteittain iän myötä, ja se koskee noin 115,4 miljoonaa ihmistä vuoteen 2050 mennessä maailmanlaajuisesti (Fan ja Chiu, 2014). On yleisesti hyväksytty, että AD on monimutkainen neurodegeneratiivinen sairaus, jossa on useita patologioita, jotka liittyvät pääasiassa kolinergisen siirron rappeutumiseen, oksidatiiviseen stressiin, neuroinflammaatioon ja niin edelleen (Coyle et al., 1983; Aucoin et al., 2005; Lin ja Beal, 2006; Verri et al., 2012; Heneka et al., 2015; Bassani et al., 2017). Asetyylikoliiniesteraasin (AChE) estäjiä, kuten donepetsiiliä, rivastigmiiniä ja galantamiinia, määrätään ensisijaisesti Alzheimerin taudin kliiniseen hoitoon alkuvaiheessa (Kwon ym., 2010; Rijpma ym., 2014; Kumar ja Singh, 2015). Lisäksi antioksidantteja ja tulehduskipulääkkeitä käytetään sananmukaisesti AD:n liitännäishoidossa (Zhou ym., 2016; Demirci ym., 2017). Kaikkien näiden aineiden teho on kuitenkin rajallinen, koska ne menettävät tehonsa vähitellen taudin edetessä, ja lääkkeisiin liittyy myös monia toksisia sivuvaikutuksia (Zhou ym., 2016; Jeon ym., 2017; Lu ym., 2018). Tällä hetkellä ei nimittäin ole saatavilla tyydyttävää hoitoa AD:n parantamiseksi tai sen etenevän kulun muuttamiseksi.

Harmaliini (HAL) ja harmiini (HAR) ovat Peganum harmala L:n runsaita farmakologisia β-karboliinialkaloideja, joilla on samankaltaiset kemialliset rakenteet (Li et al., 2017b). Niillä on merkittävä AChE: n, monoamiinioksidaasin (MAO) ja myeloperoksidaasin (MPO) estävä vaikutus, antioksidanttinen, anti-inflammatorinen, kasvainten vastainen ja verenpainetaudin vastainen vaikutus, ja ne voivat myös vaikuttaa erilaisten välittäjäaineiden sisältöihin, jolloin ne voivat johtaa biokemiallisiin, fysiologisiin ja käyttäytymismuutoksiin eläimillä ja ihmisillä (Mahmoudian et ai.., 2002; Frison et al., 2008; Jiménez et al., 2008; Herraiz et al., 2010; Louis et al., 2010; Bensalem et al., 2014; Wang et al., 2015; Li et al., 2017a). Aiempien tutkimustemme mukaan HAL ja HAR osoittivat samanlaista AChE:n estoa verrattuna galantamiiniin in vitro (Zhao et al., 2013). Lisäksi P. harmalan kokonaisalkaloidit (28 mg/kg), jotka sisältävät pääasiassa HAL:a ja HAR:a, osoittivat parantavaa vaikutusta skopolamiinin ja 30-prosenttisen etanolin aiheuttamiin oppimisen ja muistin puutoksiin (He et al., 2015b). Myöhemmin He et al. (2015a) tutkimus vahvisti edelleen, että HAR (20 mg/kg) voisi parantaa skopolamiinin indusoimien hiirten heikentynyttä muistia parantamalla kolinergisiä toimintoja AChE:n estämisen kautta. Viimeisimmät tutkimukset kuitenkin osoittivat, että HAR ei ollut ainoastaan monilääkeresistenssiin liittyvän proteiinin isomuodon 2 (MRP2) substraatti, vaan sillä oli myös heikko metabolinen stabiilisuus, ja se johti lopulta huomattavasti alhaisempaan biologiseen hyötyosuuteen kuin HAL eri eläimillä (Li et al., 2017b). Näin ollen on spekuloitu, että HAL:n tehokas annos AD:tä vastaan voi olla paljon pienempi kuin HAR:n. Siksi olisi suoritettava järjestelmällinen vertailututkimus näiden kahden analogin muistinvastaisista vaikutuksista ja mekanismeista, jotta etsitään suositeltavampi ehdokasyhdiste AD-hoitoa varten.

Tässä tutkimuksessa verrattiin HAL:n ja HAR:n moduloivia vaikutuksia skopolamiinin aiheuttamiin muistihäiriöihin käyttämällä käyttäytymisarviointia Morrisin vesilabyrintissä (MWM). MWM:ää on käytetty laajasti avaruudellisen oppimisen ja muistin neurobiologian ja neurofarmakologian tutkimuksessa, ja sillä on tärkeä rooli neurokognitiivisten häiriöiden, kuten Alzheimerin taudin kaltaisten neurologisten häiriöiden jyrsijämallien validoinnissa (Bromley-Brits et ai., 2011). Lisäksi suoritettiin kattavasti biokemialliset määritykset, western blotting -analyysi sekä immunofluoresenssianalyysi HAL:n ja HAR:n mahdollisten vaikutusten selvittämiseksi joihinkin AD:n etenemisen taustalla oleviin mekanismeihin. Tämän tutkimuksen tuloksista on hyötyä arvioitaessa β-karboliinialkaloidien antiamnestisia vaikutuksia jatkotutkimuksessa ja -kehityksessä, ja ne voivat tarjota arvokasta tietoa AD:n kliinistä hoitoa varten.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Harmaliini, HAR, L-tryptofaani (L-Trp), 5-hydroksitryptamiini (5-HT), 5-hydroksiindoli-3-etikkahappo (5-HIAA), asetyylikoliinikloridi (ACh), koliinikloridi (Ch), γ-aminovoihappo (γ-GABA), L-glutamiinihapon mononatriumsuolan monohydraatti (L-Glu), L-fenyylialaniini (L-Phe), L-tyrosiini (L-Tyr), teofylliini ja kaikki muut käytetyt kemikaalit ostettiin Sigma-Aldrich, Co., Ltd. (St. Louis, MO, Yhdysvallat). Skopolamiinihydrobromidi ja donepetsiilihydrokloridimonohydraatti ostettiin TCI (Shanghai) Development, Co., Ltd.:ltä. (Shanghai, Kiina). Karboksimetyyliselluloosanatrium (CMC-Na) ja NaCl saatiin Meilunbio® Biotech, Co., Ltd.:ltä. (Dalian, Kiina). Yhdistetty titaanidioksidiväriaine ostettiin Shanghai Dyestuffs Research Institute, Co., Ltd.:stä. (Shanghai, Kiina). BCA-proteiinien määrityssarja, RIPA-lyysipuskuri, naudan seerumin albumiini (BSA), PBST (10X), 30-prosenttinen akryyliamidi, 10-prosenttinen SDS, glysiini, näytteen latauspuskuri (4X) ja TEMED ostettiin YEASEN Biotechnology, Co., Ltd.:ltä. (Shanghai, Kiina). Fosfolipaasi-inhibiittori ja proteaasi-inhibiittori ostettiin Roche Applied Science -yritykseltä (Foster City, CA, Yhdysvallat). PVDF-kalvo ja ImmobilonTM Western kemiluminesenssi HRP-substraatti ostettiin Milliporelta (Billerica, MA, Yhdysvallat). Kanin anti-AChE, kanin anti-koliiniasetyylitransferaasi (ChAT), kanin anti-MPO ja anti-glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), HRP-konjugoidut anti-kani IgG-vasta-aineet ja merkkiaine ostettiin Abcam Technologyltä (Cambridge, MA, Yhdysvallat). HPLC-luokan asetonitriili, metanoli ja muurahaishappo ostettiin Fisher Scientific, Co. (Santa Clara, CA, Yhdysvallat). Deionisoitu vesi (>18 mΩ) puhdistettiin Milli-Q Academic Systemillä (Millipore, Corp., Billerica, MA, Yhdysvallat). Kaikki muut kemikaalit olivat analyyttistä laatua.

eläimet

Sata kahdeksan uros C57BL/6-hiirtä (iältään 10 viikkoa) saatiin Shanghain perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopiston lääketurvallisuuden arviointi- ja tutkimuskeskuksesta. Hiiret kasvatettiin hyvin valaistussa ilmastoidussa huoneessa (25 ± 1 °C) tavanomaisissa ympäristöolosuhteissa (suhteellinen kosteus: 60-65 %, 12 tunnin valo-pimeä-vuorokausijakso: valo päällä kello 7:00-19:00), ja niille annettiin vapaata pääsyä jyrsijöiden ruokaan ja vesijohtoveteen. Kaikki eläinkäyttötoimenpiteet olivat Kiinan valtion tiede- ja teknologiakomitean 14. marraskuuta 1988 antamien eläinkokeita koskevien säännösten mukaisia, ja Shanghain perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopiston koe-eläinten eettinen komitea hyväksyi ne (nro. SUTCM-2011-1107; Hyväksymispäivä: 10. marraskuuta 2011).

Lääkkeen anto

HAL:n ja HAR:n biologisen hyötyosuuden eron perusteella annoksiksi asetettiin 2, 5 ja 10 mg/kg HAL:lle ja 10, 20 ja 30 mg/kg HAR:lle (Zhang, 2013; Shi et al., 2014). Sata kahdeksan hiirtä jaettiin satunnaisesti yhdeksään ryhmään (12 hiirtä ryhmää kohti), nimittäin kontrolliryhmään (kantaja-aine, 0,5 % CMC-Na), skopolamiiniryhmään (1 mg/kg), donepetsiiliryhmään (positiivinen kontrolli, 5 mg/kg), HAL-ryhmiin (2, 5 ja 10 mg/kg eli matalat: L-, keskisuuret: M- ja korkeat: H-annokset) ja HAR-ryhmiin (10, 20 ja 30 mg/kg eli L-, M- ja H-annokset). Kuten kuvasta 1 käy ilmi, ennen MWM-testiä kontrolli- ja skopolamiiniryhmille annettiin suun kautta 0,5-prosenttista CMC-Na-liuosta, ja HAL-ryhmille (L-, M- ja H-annokset), HAR-ryhmille (L-, M- ja H-annokset) ja donepetsiiliryhmille (5 mg / kg) annettiin ruokatorven kautta seitsemänä peräkkäisenä päivänä. Päivästä 8 päivään 16 skopolamiinia (1 mg/kg) ruiskutettiin vatsansisäisesti (i.p.) kaikkiin ryhmiin paitsi kontrolliryhmään, joka sai normaalia suolaliuosta 30 minuuttia eri hoitojen jälkeen. Tämän jälkeen käyttäytymiskokeet suoritettiin päivittäin 30 min skopolamiinin tai normaalin suolaliuoksen i.p.-injektion jälkeen.

Käyttäytymisen arviointi Morrisin vesilabyrintissa

MWM-testiä käytettiin arvioimaan HAL:n ja HAR:n vaikutuksia hiirten avaruudelliseen oppimiseen ja muistiin Richard Morrisin vuonna 1982 aiemmin kuvaamalla tavalla pienin muutoksin (Morris et al., 1982; He ym., 2015a; Singh ym., 2016).

MWM-laitteisto koostui valkoisesta pyöreästä vesisäiliöstä (halkaisija: 120 cm ja korkeus: 50 cm), jota ympäröivät erilaiset visuaaliset vihjeet (tähti, neliö, suorakulmio, suorakulmio ja ympyrä jne.) pylväissä kiinteissä paikoissa koko kokeen ajan. Säiliö valkaistiin lisäämällä myrkytöntä väriainetta, titaanidioksidiyhdistettä, 22 ± 2 °C:n lämpötilassa siten, että alusta oli näkymätön veden pinnan alla. Säiliö oli käytännössä jaettu neljään yhtä suureen kvadranttiin, jotka olivat kaakkoinen, koillinen, lounainen ja luoteinen. Valkoinen alusta (halkaisija: 10 cm ja korkeus: 25 cm) oli keskitetty lounaaseen nelikenttään (Jeon et al., 2017; Kouémou et al., 2017; Lu et al., 2018). Koko kokeellinen menettely koostui sopeutumiskoulutuksesta (1 päivä, kerran päivässä), näkyvän alustan testistä (1 päivä, neljä kokeilua päivässä), piilotetun alustan testeistä (5 päivää, neljä kokeilua päivässä) ja avaruudellisesta koettimen kokeesta (24 h viimeisen piilotetun alustan testin jälkeen, kerran päivässä).

Sopeutumiskoulutuksen (1 päivä, kerran päivässä), MWM-testin ensimmäisenä päivänä (lääkekäsittelyjen 8-päivänä), kukin hiiri sijoitettiin vesisäiliön sisälle uimaan 60 s: n ajan, jotta se saisi akklimatisoitumisjakson. Seuraavana päivänä (lääkehoitojen 9. päivä) hiirten visuaalisten, sensoristen ja motoristen ominaisuuksien tutkimiseksi näkyvä alusta sijoitettiin 1 cm vedenpinnan yläpuolelle, ja jokaisen hiiren annettiin löytää alusta 60 s. Testi (1 päivä, neljä kokeilua päivässä) suoritettiin ennen piilotetun alustan kokeilua pätevien hiirten seulomiseksi. Tämän jälkeen alusta upotettiin 1 cm vedenpinnan alapuolelle piiloalustakokeissa (5 päivää, neljä koetta päivässä, lääkehoitojen päivät 10-14). Uintiaktiivisuus tallennettiin yläpuolella olevalla videokameralla ja analysoitiin tietokoneistetun seuranta- ja kuva-analysaattorijärjestelmän (RD1101-MWM-G, Shanghai Mobile Datum Information Technology Company, Shanghai, Kiina) avulla. Hiiret vapautettiin säiliöön pää säiliön seinään päin yhdestä neljästä kvadrantista peräkkäin (koillisesta, pohjoisesta, idästä ja kaakosta), ja niiden annettiin löytää alusta 60 s. Jos hiiri ei löytänyt alustaa, sen olisi ohjattava varovasti erityisellä kokeilijalla, ja sen annettiin pysyä 15 s alustalla. Kunkin kokeen jälkeen jokainen hiiri vietiin häkkiinsä ja sen annettiin kuivua lämmittimen alla. Pakenemisviive ja pakenemisnopeus kirjattiin jokaisesta kokeesta. Tilakokeessa (lääkehoitojen 15. päivä) alusta poistettiin säiliöstä. Jokainen hiiri asetettiin vesisäiliöön edellisen alustan sijainnin (kohdekvadrantti) vastakkaisesta kvadrantista (hetkellisesti luoteesta) 60 s muistin säilyttämiskokeen saamiseksi (Lee et ai., 2016; Liu et ai., 2017; Malik et ai., 2017). Aika kohdekvadrantissa ja ylitysmäärä kirjattiin.

Aivokudosten kerääminen

16. päivänä lääkehoitojen jälkeen kaikki hiiret nukutettiin ja plasma kerättiin oftalmektomialla, ja sitten aivokudokset kerättiin dekapitaation jälkeen. Kussakin ryhmässä alaryhmän eläinten aivoja käytettiin immunofluoresenssianalyysiin ja muita eläimiä biokemialliseen ja western blotting -analyysiin. Uhrauksen jälkeen aivokudokset poistettiin välittömästi, huuhdeltiin normaalilla suolaliuoksella, pyyhittiin pintavesikosteus suodatinpaperilla ja punnittiin. Kunkin aivokuori ja hippokampus jaettiin kahteen osaan (vasempaan ja oikeaan) jäällä. Osa niistä kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä immunofluoresenssianalyysiä varten, ja toiset jäädytettiin välittömästi nestemäisellä typellä ja säilytettiin sitten -80 °C:ssa analyysiin asti.

Biokemiallinen määritys

Aivokuori ja hippokampus homogenisoitiin jääkylmässä 0.1 M fosfaattipuskurissa (pH 7,4), ja 10 %:n (w/v) homogenaatit sentrifugoitiin 4 °C:ssa 12 000 rpm:n kierrosnopeudella 10 minuutin ajan, ja supernatantit erotettiin toisistaan, minkä jälkeen ne varastoitiin -80 °C:n lämpötilaan biokemiallista arviointia varten (Malik ym, 2017). AChE:n, ChAT:n, superoksididismutaasin (SOD), glutationiperoksidaasin (GSH-px), maleiinidiadehydin (MDA), MPO:n, tuumorinekroositekijä α:n (TNF-α), interleukiini 1β:n (IL-1β), interleukiini 6:n (IL-6), interleukiini 10:n (IL-10), ja typpioksidi (NO) aivokuoren ja/tai hippokampuksen homogenaateista määritettiin ELISA-menetelmällä käyttäen kaupallisesti saatavilla olevia määrityssarjoja (Jiancheng, Nanjing, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Erityisesti edellä mainittujen biokemiallisten tekijöiden tasot aivokuoressa ja hippokampuksessa normalisoitiin käyttämällä kunkin näytteen proteiinipitoisuutta. Määritykset tehtiin kahtena kappaleena.

Western Blotting Analysis

Aivokuori ja hippokampus homogenisoitiin jääkylmässä 50 mM Tris-HCl-puskurissa (pH 7,4), joka sisälsi fosfataasi-inhibiittoria ja proteaasi-inhibiittoria. Sentrifugoinnin (12 000 rpm) jälkeen 10 minuutin ajan 4 °C:ssa kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin BCA-proteiinimäärityssarjalla. Proteiininäytteet sekoitettiin neljänneksen tilavuuteen latauspuskuria ja kuumennettiin sitten 5 minuuttia 100 °C:ssa. Kustakin näytteestä elektroforeerattiin 20 μg proteiinia 8 % SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Tämän jälkeen kalvo estettiin 1 tunnin ajan 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla huoneenlämmössä ja inkuboitiin anti-GAPDH:lla (1:5000), anti-AChE:llä (1:1000), anti-ChAT:lla (1:1000) ja anti-MPO:lla (1:1000) 4 °C:ssa yön yli. Tämän jälkeen kalvot huuhdeltiin huolellisesti PBST:llä ja inkuboitiin sitten HRP-konjugoidulla anti-kaniini (1:5000) sekundäärisellä vasta-aineella 2 tunnin ajan huoneenlämmössä. Kun proteiinibändit oli pesty kokonaan PBST:llä, ne visualisoitiin ECL prime kitillä.

Immunofluoresenssianalyysi

Myeloperoksidaasin muodostuminen visualisoitiin immunofluoresenssimikroskopialla aiemmin kuvatulla tavalla pienin muutoksin (Gray ym., 2008). Kiinnittämisen jälkeen 4-prosenttiseen paraformaldehydiin korteksit leikattiin 5 μm paksuiksi sagittaalisiksi leikkauksiksi, ja ne deparafinoitiin ja käsiteltiin immunofluoresenssianalyysiä varten. Aivoleikkeet asetettiin sitruunahappoliuokseen (pH 6,0) antigeenin korjaamista varten mikroaaltouunissa. Tämän jälkeen autofluoresenssin sammutus suoritettiin 5 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun leikkeet oli estetty 2 %:n BSA:ssa, ne tutkittiin anti-MPO:lla (1:100) yön yli 4 °C:ssa. Tämän jälkeen leikkeet pestiin PBS:llä (pH 7,4) kolme kertaa ja inkuboitiin HRP-konjugoidulla anti-kaniinivasta-aineella (1:300) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen käytettiin 4′,6-diamidino-2-fenylindolia (DAPI) DNA:n vastavärjäykseen, ja aivoleikkeitä tarkasteltiin fluoresenssimikroskoopilla (Nikon ECLIPSE C1, Japani), ja kuvat otettiin vastaavasti. Tässä DAPI:n tai MPO:n fluoresenssi mitattiin vastaavasti 330-380 tai 510-560 nm:n heräteaallonpituudella ja 420 tai 590 nm:n emissioaallonpituudella.

HAL:n ja HAR:n vaikutukset hermovälittäjäaineisiin

Extraktiomenetelmä

Nopeaa, luotettavaa ja käytännöllistä saostamismenetelmää sovellettiin aivokuorihomogenaattien ja veriplasmanäytteiden valmistamiseen. 100 μl näytettä lisättiin 200 μl:aan jääkylmää asetonitriiliä, joka sisälsi 60 ng/ml IS:ää, 1,5 ml:n sentrifugiputkessa ja sekoitettiin vortexillä 1 minuutin ajan. Tämän jälkeen seosta sentrifugoitiin 12 000 rpm 10 minuutin ajan (4 °C). Kunkin näytteen supernatantista injisoitiin 5 μl:n aliquot-annos ultrasuorituskykyiseen nestekromatografiaan yhdistettynä sähkösuihku-ionisaatio (ESI) kvadrupoli-tandem-massaspektrometriaan (UPLC-ESI-MS/MS) kvantitatiivista analyysia varten.

UPLC-ESI-MS/MS-analyysi

Eri välittäjäaineiden pitoisuudet kvantifioitiin samanaikaisesti SHIMADZU LC-30AD UPLC-järjestelmällä (Shimadzu, Kioto, Japani), joka oli liitetty AB Sciex QTRAP® 6500 -kolmoisella kvadrupoli-massaspektrometrillä (SCIEX, Yhdysvallat), joka oli varustettu ESI-lähteellä, jossa käytettiin positiivisen ionin havaitsemistilaa moninkertaisen reaktion seurantaa varten. Kromatografinen erottelu suoritettiin käyttämällä ZIC-cHILIC-kolonnia (150 mm × 2,1 mm, 3 μm, Merck-Sequant, Saksa), jossa oli SeQuant ZIC-cHILIC-suojakolonni (20 mm × 2,1 mm, 5 μm, Merck-Sequant, Saksa). Liikkuva faasi, asetonitriili – vesi (65:35, v/v), joka sisälsi 0,1 % muurahaishappoa, annettiin virtausnopeudella 0,2 ml/min. Massaspektrometrin suojaamiseksi kontaminaatioilta virtaus ohjattiin hukkaan ensimmäisen minuutin aikana injektion jälkeen. Kaikki muut instrumenttiparametrit asetettiin aiemman tutkimuksemme mukaisesti (Jiang, 2016). UPLC-ESI-MS/MS-menetelmä oli hyvin validoitu ja sitä sovellettiin menestyksekkäästi neurotransmitterien pitoisuuksien määrittämiseen aivokuoren homogenoiduissa aineissa ja plasmassa (Jiang, 2016).

Statistinen analyysi

Statistinen arviointi tehtiin SPSS-ohjelmiston versiolla 18.0, ja tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Esitetyt pakenemisviiveen ja polun pituuden tiedot MWM-testissä analysoitiin toistettujen toimenpiteiden kaksisuuntaisella ANOVA:lla. Muut käyttäytymistiedot ja biomarkkereiden muutokset in vitro testattiin yksisuuntaisella ANOVA:lla useita vertailuja varten. Merkitsevät tulokset merkittiin tavanomaisten kriittisten P-arvojen mukaisesti: #P < 0.05; ##P < 0.01; ###P < 0.001, vs. kontrolliryhmä. ∗P < 0.05; ∗∗P < 0.01; ∗∗∗P < 0.001, vs. skopolamiinin aiheuttama ryhmä.

Tulokset

HAL ja HAR heikensivät skopolamiinilla käsiteltyjen hiirten kognitiivista toimintahäiriötä MWM:ssä

HAL:n (L-, M- ja H-annokset) ja HAR:n (L-, M- ja H-annokset) vaikutusten selvittämiseksi spatiaaliseen oppimiseen ja muistiin tehtiin MWM-tehtävä skopolamiinin aiheuttamassa muistihäiriöisessä muistin heikentymishiiressä. Kaksisuuntainen toistettujen toimenpiteiden analyysi sekamallilla osoitti, että latenssi alustan saavuttamiseen oli merkittävästi erilainen hiirten koeryhmien (F(8,396) = 26.011, P < 0.001) ja hankintakoulutuksen päivien (F(4,396) = 15.274, P < 0.001) välillä. Ryhmien ja päivien välillä ei ollut merkittävää vuorovaikutusta (F(32,396) = 1.132, P > 0.05), mikä viittaa siihen, että ryhmien väliset erot olivat riippuvaisia hoidosta. Kuten kuvassa 2 esitetään, piilotetun alustan testauksessa pakenemisen latenssi ja polun pituus skopolamiinin aiheuttamassa ryhmässä olivat merkittävästi pidempiä kuin kontrolliryhmässä neljännellä (Kuva 2A, F (8,99) = 3.135, P < 0.01; Kuva 2B, F(8,99) = 4.074, P < 0.01) ja viidentenä päivänä (Kuva 2A, F(8,99) = 4.164, P < 0.01; Kuva 2B, F(8,99) = 4.548, P < 0.01), mikä osoitti onnistuneesti rakennetun hiirten muistin heikkenemismallin. Skopolamiinin aiheuttamat kognitiiviset puutteet kumoutuivat kuitenkin sekä HAL:lla että HAR:lla. Skopolamiinin aiheuttamaan ryhmään verrattuna pakenemisen latenssi ja polun pituus vähenivät tehokkaasti HAL- (L-, M- ja H-annokset) ja HAR- (M- ja H-annokset) -käsitellyissä ryhmissä neljännellä (Kuva 2A, F(8,99) = 4.975, P < 0.01; F(8,99) = 2.816, P < 0.05; F(8,99) = 2.795, P < 0.05; Kuva 2B, F(8,99) = 3.836, P < 0.01; F(8,99) = 3.231, P < 0.01; F(8,99) = 2.658, P < 0.05; Kuva 2C, F(8,99) = 4.673, P < 0.01; F(8,99) = 4.881, P < 0.01; Kuva 2D, F(8,99) = 3.817, P < 0.01; F(8,99) = 3.129, P < 0.01) ja viidennen päivän (Kuva 2A, F(8,99) = 12.637, P < 0.001; F(8,99) = 2.802, P < 0.05; F(8,99) = 2.772, P < 0.05; Kuva 2B, F(8,99) = 4.014, P < 0.01; F(8,99) = 2.722, P < 0.05; F(8,99) = 2.531, P < 0.05; Kuva 2C, F(8,99) = 4.574, P < 0.01; F(8,99) = 4.632, P < 0.01; Kuva 2D, F(8,99) = 2.547, P < 0.05; F(8,99) = 3.905, P < 0.01). Kuitenkin, kun hoidettiin pienellä HAR-annoksella 10 mg / kg (L-annosryhmä), pakenemisen latenssi ja polun pituus eivät vähentyneet merkittävästi koko harjoittelujakson aikana neljännellä (Kuva 2C, F (8,99) = 1.182, P > 0,05; Kuva 2D, F(8,99) = 0,494, P > 0,05) ja viidentenä päivänä (Kuva 2C, F(8,99) = 0,873, P > 0,05; Kuva 2D, F(8,99) = 0,201, P > 0,05). Kuvasta 2 voidaan myös nähdä, että donepetsiilillä käsiteltyjen (5 mg / kg) pakenemislatenssi ja polun pituus lyhenivät huomattavasti verrattuna skopolamiinilla indusoidun ryhmän ryhmään neljännellä (Kuva 2A, F (8,99) = 2.668, P < 0.05; Kuva 2B, F(8,99) = 2.643, P < 0.05) ja viidentenä päivänä (Kuva 2A, F(8,99) = 2.780, P < 0.05; Kuva 2B, F(8,99) = 2.897, P < 0.05) harjoittelukokeilun kolmannella harjoitusjaksolla

Piilotetun alustan testausta seuraavana päivänä suoritettiin avaruudellinen koekoe ottamalla alusta pois kaikkien hiirten avaruudellisen muistin arvioimiseksi. Kuten kuvasta 3 näkyy, ohitusfrekvenssi laski huomattavasti skopolamiinin aiheuttamassa ryhmässä (F(8,81) = 5.498, P < 0.05), mikä osoittaa, että 1 mg/kg skopolamiinia vahingoitti hiirten avaruudellisen muistin muodostumista. Erityisesti HAR (L-annos) -hoitoryhmää (F (8,81) = 0.494, P > 0.05) lukuun ottamatta muut HAL (L-, M- ja H-annokset) ja HAR (M- ja H-annokset) -hoitoryhmät nostivat dramaattisesti ohitustaajuutta (F (8,81) = 11.667, P < 0.01; F(8,81) = 9.072, P < 0.01; F(8,81) = 4.507, P < 0.05; F(8,81) = 7.063, P < 0.05; F(8,81) = 8.583, P < 0.01), ja HAL-L-annosryhmän lisäys oli huomattavampi verrattuna muihin ryhmiin (kuva 3). Lisäksi donepetsiilillä käsitelty (5 mg / kg) -ryhmä lisäsi myös merkittävästi ohitusfrekvenssiä verrattuna skopolamiinilla indusoituihin hiiriin (kuva 3, F(8,81) = 5.345, P < 0.05). Kaikki nämä tulokset viittasivat siihen, että HAL (L-, M- ja H-annokset) ja HAR (M- ja H-annokset) voisivat parantaa skopolamiinin aiheuttamien kognitiivisten toimintahäiriöiden hiirten avaruudellista muistikykyä, ja HAL:lla oli voimakkaampia vaikutuksia kuin HAR:lla avaruudelliseen oppimiseen ja muistiin MWM:ssä.

HAL:n ja HAR:n vaikutukset skopolamiinin aiheuttamaan kolinergiseen järjestelmään, oksidatiiviseen stressiin ja tulehdukseen

HAL:n ja HAR:n mahdollisten mekanismien tarkemmaksi selvittämiseksi skopolamiinin aiheuttaman muistin parantamisessa tutkittiin moninaisten biokemiallisten tekijöiden ja proteiini-ilmaisujen tasoja, jotka liittyvät kolinergiseen järjestelmään, oksidatiiviseen stressiin ja tulehdukseen. Kuvissa 4, 5 esitetään erilaisten biokemiallisten tekijöiden muutokset aivokuoressa tai hippokampuksessa, ja kuvissa 6-8 esitetään HAL:n ja HAR:n vaikutukset hiirten aivokuoren proteiini-ilmentymiin.

HAL:n ja HAR:n vaikutukset kolinergisiin vajaatoimintoihin

HAL:n ja HAR:n vaikutusten selvittämiseksi aivojen kolinergiseen toimintaan arvioitiin AChE:n ja ChAT:n aktiivisuudessa ja proteiinipitoisuuksissa tapahtuneita muutoksia kaikkien hiirten aivokuori- ja hippokampuskudoksissa. Kuten kuvista 4A,D käy ilmi, skopolamiinihoito 1 mg/kg lisäsi merkittävästi AChE:n aktiivisuutta aivokuoressa ja hippokampuksessa (F(8,81) = 10,553, P < 0,01; F(8,81) = 6,177, P < 0,05). Lukuun ottamatta HAR-L-annosryhmää aivokuoressa muut HAL- (L-, M- ja H-annokset) ja HAR- (M- ja H-annokset) -käsittelyryhmät vähensivät huomattavasti AChE-aktiivisuutta (Kuva 4A, F(8,81) = 10.837, P < 0.01; F(8,81) = 8.621, P < 0.05; F(8,81) = 15.177, P < 0.01; F(8,81) = 8.615, P < 0.05; F(8,81) = 16.330, P < 0.001; Kuva 4D, F(8,81) = 46.593, P < 0.001; F(8,81) = 34.179, P < 0.001; F(8,81) = 7.968, P < 0.05; F(8,81) = 4.769, P < 0.05; F(8,81) = 49.802, P < 0.001; F(8,81) = 46.665, P < 0.001). Samoin donepetsiilillä käsitelty ryhmä vähensi selvästi AChE: n aktiivisuutta verrattuna skopolamiinin aiheuttaman ryhmän tasoihin (Kuva 4A, F(8,81) = 13.138, P < 0.01; Kuva 4D, F(8,81) = 7.400, P < 0.05). Lisäksi skopolamiinin aiheuttama ryhmä osoitti merkittävää ChAT-aktiivisuuden vähenemistä sekä aivokuoressa että hippokampuksessa (Kuva 4B, F(8,81) = 5.481, P < 0.05; Kuva 4E, F(8,81) = 4.874, P < 0.05). Kuitenkin HAL (L- ja M-annokset) ja HAR (M- ja H-annokset) -annokset lisäsivät tuntuvasti ChAT-aktiivisuutta aivokuoressa (Kuva 4B, F(8,81) = 7.956, P < 0.05; F(8,81) = 8.390, P < 0.05; F(8,81) = 7.835, P < 0.05; F(8,81) = 51.927, P < 0.001), ja kaikkien HAL- ja HAR-hoitoryhmien ChAT-tasot hippokampuksessa olivat merkitsevästi korkeammat kuin skopolamiinin aiheuttamassa ryhmässä (Kuva 4E, F(8,81) = 18.139, P < 0.001; F(8,81) = 9.665, P < 0.01; F(8,81) = 14.113, P < 0.01; F(8,81) = 5.178, P < 0.05; F(8,81) = 7.599, P < 0.05; F(8,81) = 11.953, p < 0.01), ja HAL-L-annosryhmän vaikutus ChAT-aktiivisuuteen oli merkittävämpi verrattuna HAR-annosryhmiin.

Kuten kuvassa 6 on esitetty, verrattuna kontrolliryhmään, AChE: n proteiiniekspressiotasot aivokuoressa ja hippokampuksessa skopolamiinin aiheuttaman ryhmän aivokuoressa ja hippokampuksessa kasvoivat huomattavasti (kuva 6C, F (8,18) = 36.632, P < 0.01; kuva 6D, F (8,18) = 14.823, P < 0.05), kun taas ChAT: n proteiinipitoisuudet olivat melkein muuttumattomia (kuviot 6E ja 6E). HAL- (L-, M- ja H-annokset), HAR- (M- ja H-annokset) ja donepetsiilikäsittelyjen jälkeen, lukuun ottamatta HAR-annosta (L-annos), AChE: n proteiinitasot aivokuoressa pienenivät selvästi verrattuna skopolamiinin aiheuttamaan ryhmään (Kuva 6C, F(8,18) = 50.590, P < 0.001; F(8,18) = 16.950, P < 0.05; F(8,18) = 30.993, P < 0.01; F(8,18) = 23.821, P < 0.01; F(8,18) = 52.196, p < 0.001; F(8,18) = 29.284, p < 0.01), kun taas ChAT-tasot eivät muuttuneet (kuva 6E). Ja samanlaisia vaikutuksia AChE- ja ChAT-tasoihin havaittiin HAL- ja HAR-annoksilla (L-, M- ja H-annokset) hippokampuksessa (Kuva 6D, F(8,18) = 41.195, P < 0.001; F(8,18) = 28.111, P < 0.01; F(8,18) = 47.611, P < 0.001; F(8,18) = 30.539, P < 0.01; F(8,18) = 33.225, P < 0.01; F(8,18) = 40.032, P < 0.001; Kuva 6F). Lisäksi HAR: n estävät vaikutukset AChE-proteiinin ilmentymiseen olivat annosriippuvaisia, kun taas HAL: lla oli huomattava estävä vaikutus pienellä annoksella 2 mg / kg (Kuva 6). Siten HAL- ja HAR-hoidot estivät skopolamiinin aiheuttaman AChE-aktiivisuuden ja proteiiniekspression nousun ja ChAT-aktiivisuuden vähenemisen, mikä osoitti, että HAL ja HAR voisivat parantaa kolinergisen järjestelmän toimintaa ja lievittää käyttäytymishäiriöitä. Erityisesti HAL osoitti merkittävää parannusta pienellä annostuksella.

HAL:n ja HAR:n vaikutukset oksidatiivisen stressin merkkiaineisiin

HAL:n ja HAR:n vaikutukset antioksidanttisten entsyymien SOD:n, GSH-px:n aktiivisuuteen ja MDA:n tasoon aivokuoressa mitattiin. Kuten kuvasta 5 kävi ilmi, skopolamiinin aiheuttamassa ryhmässä SOD- ja GSH-px-aktiivisuus heikkeni näkyvästi kontrolliryhmään verrattuna (kuva 5A, F(8,81) = 12.254, P < 0.01; kuva 5B, F(8,81) = 4.577, P < 0.05). Kun taas HAL (H-annos), HAR (M- ja H-annokset) ja donepetsiilin antaminen lisäsivät merkittävästi SOD-aktiivisuutta (Kuva 5A, F(8,81) = 13.287, P < 0.01; F(8,81) = 13.424, P < 0.01; F(8,81) = 34.510, P < 0.001; F(8,81) = 8.670, P < 0.01), ja HAL-, HAR- (molemmat H-annokset) ja donepetsiilikäsittelyt nostivat selvästi GSH-px: n aktiivisuutta (Kuva 5B, F(8,81) = 6.010, P < 0.05; F(8,81) = 6.008, P < 0.05; F(8,81) = 6.860, P < 0.05). Lisäksi HAL-, HAR- (sekä M- että H-annokset) ja donepetsiili (5 mg / kg) -käsittelyillä havaittiin MDA-tason nousun merkittävää heikentymistä verrattuna skopolamiinin aiheuttamiin hiiriin (Kuva 5C, F (8,81) = 9.302, P < 0.01; F(8,81) = 6.565, P < 0.05; F(8,81) = 12.690, P < 0.01; F(8,81) = 33.627, P < 0.001; F(8,81) = 5.874, P < 0.05). Nämä tulokset viittasivat siihen, että HAL ja HAR voivat estää skopolamiinin aiheuttamia oksidatiivisia vaurioita suojaamalla aivokuorta oksidatiiviselta stressiltä. Huomattavaa oli, että hapettumisvaurioita voitiin parantaa vain suurilla annoksilla sekä HAL:n että HAR:n osalta, ja HAL:n ja HAR:n parannukset olivat yleisesti ottaen vertailukelpoisia.

HAL:n ja HAR:n vaikutukset tulehdustasoihin

Analysoitiin HAL:n ja HAR:n vaikutuksia tulehdustekijöiden MPO:n, TNF-α:n, IL-1β:n, IL-6:n ja IL-10:n aktiivisuuteen sekä NO:n tasoon aivokuoressa tai hippokampuksessa. MPO:n (aivokuori ja hippokampus) ja TNF-α:n (aivokuori) aktiivisuudet olivat koholla skopolamiinin aiheuttamissa hiirissä verrattuna kontrollihiiriin (kuva 4C, F(8,81) = 34.740, P < 0,001; Kuva 4F, F(8,81) = 6,729, P < 0,05; Kuva 5D, F(8,81) = 6,316, P < 0,05), mutta IL-1β:n, IL-6:n ja IL-10:n tasot eivät muuttuneet (kuvat 5F-H). HAL-, HAR- (sekä M- että H-annokset) ja donepetsiiliannokset johtivat kuitenkin MPO-aktiivisuuden merkittävään vähenemiseen aivokuoressa ja hippokampuksessa annosriippuvaisesti (Kuva 4C, F(8,81) = 10.435, P < 0,01; F(8,81) = 32,309, P < 0,001; F(8,81) = 16,397, P < 0,01; F(8,81) = 31,291, P < 0.001; F(8,81) = 7.129, p < 0.05; Kuva 4F, F(8,81) = 7.212, p < 0.05; F(8,81) = 10.533, p < 0.01; F(8,81) = 9.150, P < 0.01; F(8,81) = 18.903, P < 0.001; F(8,81) = 11.641, P < 0.01), ja HAL- (L-, M- ja H-annokset), HAR- (M- ja H-annokset) ja donepetsiilihoidot heikentävät myös TNF-α:n aktiivisuutta aivokuoressa (Kuva 5D, F(8,81) = 10.377, P < 0,01; F(8,81) = 28,257, P < 0,001; F(8,81) = 31,088, P < 0,001; F(8,81) = 15,966, P < 0,001; F(8,81) = 23,530, P < 0,001; F(8,81) = 5,909, P < 0,05). Lisäksi HAR-L-annosryhmää lukuun ottamatta NO-tason nousun huomattava vaimeneminen havaittiin muissa HAL-, HAR- ja donepetsiilihoitohiirissä verrattuna skopolamiinin aiheuttamiin amnesiahiiriin (Kuva 5E, F (8,81) = 21.319, P < 0.001; F(8,81) = 12.996, P < 0.01; F(8,81) = 11.911, P < 0.01; F(8,81) = 5.227, P < 0.05; F(8,81) = 8.799, P < 0.01; F(8,81) = 17,349, p < 0,001), ja HAL:n TNF-α:ta ja NO:ta estävät vaikutukset olivat voimakkaampia kuin HAR:n.

Kuten kuvasta 7 käy ilmi, kontrollihiiriin verrattuna kortikaalisen ja hippokampuksen MPO:n proteiiniekspressiotasot skopolamiinin aiheuttamissa hiirissä olivat koholla (kuva 7C, F(8,18) = 29.975, P < 0.01; kuva 7D, F(8,18) = 32.014, P < 0.01). Donepetsiilin, HAL: n ja HAR: n (L-, M- ja H-annokset) antamisen jälkeen MPO: n proteiini-ilmaisut laskivat ilmeisesti aivokuoressa ja hippokampuksessa verrattuna skopolamiinin aiheuttamaan ryhmään. Lisäksi immunofluoresenssimäärityksen tulokset paljastivat myös, että HAL- ja HAR-hoidot voisivat vähentää silmiinpistävästi aivokuoren MPO-ekspressiota annosriippuvaisella tavalla, ja HAL:n ja HAR:n estot olivat vertailukelpoisia (kuva 8). Kaikki nämä havainnot viittasivat siihen, että HAL ja HAR voisivat vähentää skopolamiinin aiheuttamaa tulehdusvauriota estämällä aivokuoren ja hippokampuksen tulehdusta.

HAL: n ja HAR: n modulaattorivaikutukset skopolamiinilla käsiteltyjen hiirten hermovälittäjäaineisiin

Erilaiset plasman ja kortikaaliset hermovälittäjäaineet arvioitiin UPLC-ESI-MS / MS: n avulla, ja muutokset on esitetty kuvissa 9, 10. vastaavasti. Aiemmin vahvistetun välittäjäaineiden määritysmenetelmän perusteella ACh:n, Ch:n, L-Trp:n, 5-HT:n, L-Glu:n, L-Phe:n, L-Tyr:n pitoisuudet plasmassa ja ACh:n, Ch:n, L-Trp:n, γ-GABA:n, L-Glu:n, L-Phe:n, L-Tyr:n pitoisuudet aivokuoressa olivat kvantitatiivisen määritysrajan alarajan yläpuolella, minkä jälkeen kaikki ne onnistuttiin määrittämään kvantitatiivisesti.

Skopolamiinin indusoimisen jälkeen annoksella 1 mg / kg ACh: n, L-Trp: n, 5-HT: n, L-Glu: n ja L-Phe: n pitoisuudet pienenivät plasmassa (Kuva 9A, F (8,81) = 11.453, P < 0,01; Kuva 9C, F(8,81) = 23,137, P < 0,001; Kuva 9D, F(8,81) = 7,359, P < 0,05; Kuva 9E, F(8,81) = 55.531, P < 0.001; Kuva 9F, F(8,81) = 6.330, P < 0.05), kun taas L-Tyriin ei ollut vaikutusta (Kuva 9G, F(8,81) = 2.091, P > 0.05). Kuitenkin, kun HAL- ja HAR-hoitoja annettiin suurilla annoksilla, ACh- ja L-Glu-pitoisuudet kohosivat (kuvat 9A, E), ja L-Trp-pitoisuudet kohosivat selvästi HAL- (L-, M- ja H-annokset) ja HAR- (M- ja H-annokset) -annoksilla annosriippuvaisesti (kuva 9C). Lisäksi HAL- ja HAR- (M- ja H-annokset) hoidetuilla hiirillä havaittiin merkittävä 5-HT-tason nousu verrattuna skopolamiinin aiheuttamiin hiiriin (kuva 9D). HAL- ja HAR-annokset eivät kuitenkaan muuttaneet L-Phe- ja L-Tyr-pitoisuuksia (kuvat 9F, G). Lisäksi HAL (H-annos) sekä HAR (M- ja H-annokset) tuottivat vaikutuksen Ch:n pitoisuuden vähentämiseen plasmassa (kuva 9B).

Lisäksi kuvassa 10 on esitetty neurotransmittereiden vaihtelut aivokuorella. Skopolamiinin indusoimisen jälkeen ACh:n, L-Trp:n, L-Glu:n, L-Phe:n ja L-Tyr:n pitoisuudet vähenivät selvästi (kuva 10A, F(8,81) = 11.296, P < 0.01; kuva 10C, F(8,81) = 10.979, P < 0.01; kuva 10E, F(8,81) = 7.216, P < 0.05; kuva 10F, F(8,81) = 10.340, P < 0.01; Kuva 10G, F(8,81) = 6.834, P < 0.05), kun taas Ch- ja γ-GABA-pitoisuudet kohosivat merkitsevästi aivokuoressa kontrolliryhmään verrattuna (Kuva 10B, F(8,81) = 7.377, P < 0.05; Kuva 10D, F(8,81) = 5.580, P < 0.05). ACh-pitoisuudet olivat kuitenkin havaittavasti koholla HAL- (L-, M- ja H-annokset) ja HAR- (M- ja H-annokset) -ryhmissä, ja L-Trp-pitoisuudet kohosivat huomattavasti HAL- (L-, M- ja H-annokset) ja HAR- (H-annos) -ryhmissä, ja L-Glu-määrät kohosivat myös HAL- ja HAR-ryhmien suurilla annoksilla (Kuvat 10A,C,E). Lisäksi HAL- (L-, M- ja H-annokset) ja HAR- (H-annos) -käsittelyt johtivat Ch- ja γ-GABA-tasojen selvään vähenemiseen verrattuna skopolamiinin aiheuttamaan ryhmään (kuvat 10B,D). HAL:n ja HAR:n eri annoksilla oli kuitenkin vähäinen vaikutus skopolamiinin aiheuttamaan L-Phe- ja L-Tyr-tasojen vähenemiseen (kuvat 10F, G). Yleisesti ottaen HAL:n vaikutukset tärkeisiin plasman ja aivokuoren välittäjäaineisiin olivat selvempiä kuin HAR:n (kuvat 9, 10).

Keskustelu

Alzheimerin tauti on tappava etenevä hermoston rappeutumishäiriö, jossa ikääntyvä väestö ja elinajanodote kasvavat, ja on kiireellisesti löydettävä uusia lääkkeitä, jotka voivat tehokkaasti hoitaa AD: tä (Kouémou et ai, 2017). Yleisesti tiedetään, että kolinerginen hypofunktio, oksidatiivinen stressi ja neuroinflammaatio ovat yksi AD:n pääpiirteistä (Abd-El-Fattah et al., 2014; Demirci et al., 2017). Skopolamiini on ei-selektiivinen muskariinikolinergisen reseptorin antagonisti (Jang ym., 2013; Kaur ym., 2017). Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että skopolamiini voi heikentää oppimisen ja muistin kykyä ihmisillä ja eläinmalleilla, ja skopolamiinin aiheuttamaa AD-mallia käytetään laajalti kognitiivisen puutteen tutkimiseen ja AD-lääkkeiden seulontaan (Goverdhan et ai., 2012). Skopolamiini johtaa kognitiivisiin puutteisiin, jotka liittyvät kolinergisen neurotransmission vähenemiseen, lisääntyneeseen oksidatiiviseen stressiin sekä kohonneeseen tulehdukseen aivoissa (Lin ja Beal, 2006). Näin ollen lääkkeet voivat tehokkaasti parantaa kolinergistä toimintaa ja/tai heikentää oksidatiivista stressiä ja tulehdusta, ja ne voivat kääntää oppimis- ja muistihäiriöt skopolamiinin aiheuttamissa AD-hiirissä, ja ne ovat viime kädessä arvokkaita AD:n hoidossa.

Viime aikoina He et al. (2015a) osoittivat, että HAR voi estää AChE-aktiivisuutta ja parantaa merkittävästi kognitiivisesti heikentyneiden hiirten, mukaan lukien APP/PS1-siirtogeenisten ja skopolamiinin aiheuttamien AD-hiirten, spatiaalista oppimista ja muistia. Tässä tutkimuksessa verrattiin HAL:n (2, 5 ja 10 mg/kg) ja HAR:n (10, 20 ja 30 mg/kg) muistia parantavia vaikutuksia skopolamiini-indusoitujen hiirten muistiin käyttämällä MWM-käyttäytymisarviointia. Skopolamiinin (1 mg/kg) todettiin vahingoittavan hiirten avaruudellista oppimis- ja muistikykyä MWM-tehtävässä, mikä oli yhdenmukainen aiempien tutkimustemme kanssa (He et ai., 2015a; Liu et ai., 2017). HAL- (L-, M- ja H-annokset) ja HAR- (M- ja H-annokset) -hoitojen jälkeen pakenemisen latenssi ja polun pituus pienenivät ja ohitusfrekvenssi kasvoi tehokkaasti (kuvat 2, 3), mikä osoittaa, että HAL- ja HAR-annokset paransivat tuntuvasti skopolamiinin aiheuttamien hiirten oppimista ja avaruudellista muistia, ja HAL:n parannukset olivat merkittävämpiä kuin HAR:n parannukset.

HAL:n ja HAR:n oppimisen ja muistin parantamisen taustalla olevan mekanismin selvittämiseksi skopolamiinin aiheuttamissa hiirissä arvioitiin kolinergisen järjestelmän, oksidatiivisen stressin ja tulehduksen muutoksia. Kuten aiemmissa kirjallisuuksissa on raportoitu (Abd-El-Fattah et ai., 2014; Lin et ai., 2016; Demirci et ai., 2017), skopolamiinin i.p. -injektio johti kolinergisen toiminnan heikkenemiseen, kohonneeseen oksidatiiviseen stressiin ja tulehdukseen tässä tutkimuksessa. Donepetsiili on AChE:n estäjänä edustava oireenmukainen hoito lievässä ja keskivaikeassa Alzheimerin taudissa (Bohnen ym., 2005), ja viimeaikaisissa tutkimuksissa on käynyt ilmi, että se voi myös hillitä tulehdusta ja oksidatiivista stressiä (Saxena ym., 2008; Yoshiyama ym., 2010). Tässä tutkimuksessa donepetsiili (positiivinen kontrolli) pystyi tehokkaasti parantamaan näitä muutoksia skopolamiinin aiheuttamissa hiirissä ja paransi niiden oppimista ja muistia. Samoin kuin niiden toiminta in vitro (Zhao et al., 2013; Liu et al., 2014), HAL ja HAR eri annoksina eivät ainoastaan kumonneet skopolamiinin aiheuttamaa AChE-aktiivisuuden nousua, vaan johtivat myös neurotransmitterin ACh:n kohoamiseen ja Ch:n vähenemiseen aivokuoressa, hippokampuksessa tai plasmassa (kuvat 4, 9, 10). Lisäksi HAL ja HAR estivät selvästi aivokuoren AChE:n proteiinitasoja (kuvat 6C, D). Kuten Oh et al. (2009) raportoivat, ChAT-positiiviset neuronit vähenivät merkittävästi skopolamiinikäsittelyllä. Nykyiset tulokset osoittivat, että HAL ja HAR voisivat kääntää skopolamiinin aiheuttaman ChAT-aktiivisuuden vähenemisen (kuvat 4B, E), mutta niillä ei ole vaikutusta ChAT:n proteiini-ilmentymiin (kuvat 6E, F), ja se on vielä todistettava. Näin ollen nämä vahvistivat, että HAL: n ja HAR: n antiamnestiset vaikutukset skopolamiinin aiheuttamiin kognition toimintahäiriöihin liittyivät todennäköisesti kolinergisen järjestelmän (erityisesti AChE: n) muuttamiseen, ja HAL osoitti ilmeisen kolinergisen parannuksen pienellä annoksella (2 mg / kg).

Lisäksi monet tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyttä oksidatiivista stressiä pidetään laajasti merkittävänä myötävaikuttavana riskitekijänä AD: n kehittymisessä (Ghumatkar et ai., 2015; Lu et ai., 2018). HAL ja HAR saattavat toimia endogeenisina antioksidantteina, ja niillä on todettu olevan antioksidanttikapasiteettia pyyhkimällä vapaita radikaaleja (Tse-Susanna et ai., 1991; Berrougui et al., 2006a,b). Tässä tutkimuksessa skopolamiinin aiheuttamissa hiirissä havaittiin ROS:n (lipidiperoksidaation tuote, MDA) ylituotantoa ja antioksidanttientsyymien (SOD ja GSH-px) vähenemistä (kuva 5). HAL- ja HAR-annokset aktivoivat kuitenkin havaittavasti SOD:n ja GSH-px:n antioksidanttisia entsyymejä ja tukahduttivat MDA:n muodostumista skopolamiinin aiheuttaman dementian aiheuttamien hiirten aivokuoressa (kuva 5) ja paransivat sitten antioksidanttisen puolustuksen kykyä, mikä osoittaa HAL:n ja HAR:n neuroprotektiivisia vaikutuksia. Erityisesti HAL:n ja HAR:n antioksidatiiviset vaikutukset olivat yleisesti ottaen vertailukelpoisia.

Lisäksi yhä useammat todisteet viittaavat siihen, että muistin heikkeneminen liittyy lisääntyneeseen neuroinflammaatioon (Abd-El-Fattah ym., 2014). Bensalem et al. (2014) tutkimuksen mukaan HAL ja HAR osoittivat merkittävää MPO:n estoa IC50:n ollessa vastaavasti 0,08 ja 0,26 μM. HAR:n anti-inflammatorinen aktiivisuus saavutettiin estämällä TNF-α:ta ja NO:ta lipopolysakkaridilla stimuloiduissa hiiren RAW264- ja ihmisen THP-1-soluissa (Patel et al., 2012). Erityisesti skopolamiinin aiheuttamien amnesiahiirten aivoissa havaittiin korkeita pro-inflammatoristen sytokiinien (TNF-α ja MPO) ja tulehdusvälittäjäaineiden (NO) tasoja (kuvat 4, 5). Tämä tutkimus vahvisti, että HAL- ja HAR-käsittelyt pystyivät samanaikaisesti estämään NO:n muodostumista ja TNF-α:n ja MPO:n nousua, ja HAL:n estävät vaikutukset TNF-α:n ja NO:n suhteen olivat selvemmät kuin HAR:n (kuvat 4, 5). Lisäksi western blotting- ja immunofluoresenssianalyysin tulokset osoittavat edelleen, että HAL ja HAR tukahduttivat MPO:n proteiiniekspressiotasot huomattavasti (kuvat 7, 8), mikä viittaa siihen, että HAL:n ja HAR:n kyky torjua muistihäiriöitä saattaisi johtua tulehdusmarkkereiden TNF-α:n, MPO:n ja NO:n tukahduttamisesta.

Kuten tunnettua, Alzheimerin tauti liittyy erilaisten välittäjäaineiden riittämättömiin tasoihin (Kumar ja Singh, 2015; Svob Strac ym, 2015). Aiemmissa tutkimuksissa on raportoitu, että pelkkää skopolamiinia saaneilla hiirillä havaittiin huomattavaa kolinergisen järjestelmän reaktiivisuuden vähenemistä, mikä näkyi ACh-tason laskuna ja AChE-aktiivisuuden lisääntymisenä sekä ChAT-aktiivisuuden vähenemisenä (Lee ym., 2014). AD:n siirtogeeninen eläinmalli osoitti Glu-tason laskevan (Nilsen ym., 2012), ja seerumin ja plasman metabolomiikka osoitti myös Trp:n, 5-HT:n, Glu:n, Phe:n ja Tyr:n vähenemistä AD-mallihiirillä tai potilailla (Vermeiren ym., 2014; González-Domínguez ym., 2015; Weng ym., 2015; Corso ym., 2017; Li ym., 2018). Vastaavasti tuloksemme osoittivat, että skopolamiinin aiheuttamaan dementiaan liittyi ACh: n, L-Trp: n, 5-HT: n, L-Glu: n, L-Phe: n, L-Tyr: n väheneminen ja Ch: n ja γ-GABA: n kohoaminen, mikä on sopusoinnussa aiempien tutkimusten kanssa (Scali et ai.., 1999; Nilsen et al., 2012; Lee et al., 2014; Vermeiren et al., 2014; González-Domínguez et al., 2015; Kumar ja Singh, 2015; Weng et al., 2015; Zhou et al., 2016; Corso et al., 2017; Liu et al., 2017). Neurotransmittereilla on tärkeä rooli aivopiirissä, joka liittyy moniin oppimisen ja muistin osa-alueisiin, erityisesti kolinergisillä, serotonergisillä, glutametargisilla ja GABAergisilla välittäjäaineilla (Vermeiren et ai., 2014; Kumar ja Singh, 2015; Zhou et ai., 2016). On huomionarvoista, että L-Phe:tä ja L-Tyr:iä lukuun ottamatta muut muutokset voitiin kumota tehokkaasti sekä HAL- että HAR-annoksilla plasmassa ja aivokuoressa, ja HAL:n modulaatiot olivat silmiinpistävämpiä kuin HAR:n modulaatiot (kuvat 9, 10). Näin ollen näiden välittäjäaineiden säätely HAL:n ja HAR:n avulla voi olla hyödyllistä dementiahiirten oppimis- ja muistikyvyn parantamiseksi.

Yleisesti ottaen HAL (2, 5 ja 10 mg/kg) ja HAR (20 ja 30 mg/kg) osoittivat kolinergisen neurotransmission tehostumista AChE:n tukahduttamisen ja ChAT:n indusoimisen kautta, antioksidanttisen puolustuksen tehostaminen lisäämällä SOD- ja GSH-px-aktiivisuutta ja vähentämällä MDA-tuotantoa, anti-inflammatoristen vaikutusten tehostaminen alentamalla TNF-α:ta, MPO:ta ja NO:ta sekä kriittisten välittäjäaineiden (ACh, Ch, L-Trp, 5-HT, γ-GABA ja L-Glu) tasojen modulointi. Näin ollen HAL ja HAR voivat vaikuttaa moniin kohteisiin AD:n terapeuttisina lääkkeinä. Lisäksi HAL:n säädöt kolinergiseen toimintaan, tulehdukseen ja välittäjäaineisiin olivat huomattavampia kuin HAR:n, ja HAL osoitti samanlaista antioksidanttikapasiteettia kuin HAR. Erityisesti HAL:n tehokas annos (2 mg/kg) oli huomattavasti pienempi kuin HAR:n (20 mg/kg), mikä voi johtua pääasiassa näiden kahden lääkkeen biologisen hyötyosuuden ja metabolisen vakauden eroista (Li ym., 2017b). Kaiken kaikkiaan kaikki nämä tulokset osoittivat, että HAR:iin verrattuna HAL voi olla parempi kandidaattiyhdiste, jolla on paremmat antiamnestiset ja farmakokineettiset ominaisuudet Alzheimerin taudin hoidossa.

Tulokset

Yhteenvetona voidaan todeta, että HAL ja HAR pystyivät tehokkaasti parantamaan muistin heikkenemistä skopolamiinin aiheuttamassa hiirimallissa parantamalla kolinergeenisen järjestelmän toimintaa, tukahduttamalla oksidatiivista stressiä ja tulehdusvaurioita sekä moduloimalla elintärkeitä hermovälittäjäaineiden välittäjäaineen toimintaa dementia-hiivassa. Erityisesti HAL:n osalta kolinergisen toiminnan, tulehduksen ja välittäjäaineiden säätely oli merkittävämpää kuin HAR:n, ja sillä oli HAR:iin verrattavissa oleva antioksidanttivaikutus. Huomattavaa on, että HAL:n tehokas annos (2 mg/kg) oli paljon pienempi kuin HAR:n (20 mg/kg). Kokonaistulokset osoittavat, että HAL voi olla parempi lääkeehdokas oppimis- ja muistihäiriöiden, kuten Alzheimerin taudin, hoidossa. HAL:n muistia ehkäiseviä vaikutuksia ja molekyylimekanismeja on arvioitava edelleen, mikä antaa merkittävää alustavaa näyttöä Alzheimerin taudin ennaltaehkäisyä ja hoitoa varten.

Tekijöiden kontribuutiot

S-PL ja C-HW: osallistuivat tutkimussuunnitteluun, suorittivat data-analyysin, kirjoittivat tai osallistuivat käsikirjoituksen kirjoittamiseen. S-PL, Y-WW, S-LQ, Y-PZ, GD, W-ZD, CM, Q-YL, H-DG, WL ja X-MC: suorittivat kokeet.

Rahoitus

Tämä työ sai tukea Kiinan kansalliselta luonnontieteelliseltä säätiöltä (National Natural Science Foundation of China) ja Xinjiangin uiguurien autonomiselta alueelta (apuraha nro. U1130303), Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (Grant No. 81173119), Kiinan tiede- ja teknologiaministeriön avainhanke (Grant No. 2012ZX09103201-051) ja Kiinan Shanghain tieteen teknologiayhteistyöhankkeet (Grant No. 14495800200), jotka myönnettiin C-HW:lle tämän tutkimuksen taloudelliseen tukeen.

Conflict of Interest Statement

Tekijät ilmoittavat, että tutkimus suoritettiin ilman minkäänlaisia kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdolliseksi eturistiriidaksi.

.