— FRAPcms

FRAP on fluoresenssimikroskopiamenetelmä, jolla tutkitaan fluoresenssilla leimattujen molekyylien liikkuvuutta elävissä soluissa. Sitä käytetään molekyylien solun sisäisen diffuusion, biokalvojen juoksevuuden ja proteiinien sitoutumisen analysointiin.

Periaate:

FRAP voidaan suorittaa nykyaikaisella konfokaalimikroskoopilla. Se edellyttää kiinnostavan molekyylin fluoresoivaa merkintää esimerkiksi GFP-merkityllä vasta-aineella. Tyypillisessä FRAP-kokeessa on kolme erillistä vaihetta. Ensin mitataan alkufluoresenssi kiinnostavalta alueelta. Seuraavaksi fluoresoivat molekyylit fotobleached valitulla alueella. Tämä tapahtuu keskittämällä lasersäde kyseiselle alueelle, mikä johtaa fluorofoorien voimakkaaseen valaistukseen ja sammumiseen. Tämän seurauksena muuten fluoresoivassa näytteessä voidaan havaita tumma alue. Lopuksi ympäristöstä tulevat fluoresoivat molekyylit voivat diffundoitua näytteen läpi ja vaihtaa fotobleached-molekyylit ehjiin molekyyleihin. Tämä fluoresenssin palautuminen mitataan ajan kuluessa.

Koska monet tekijät voivat vaikuttaa palautumiskinetiikkaan, FRAP-kokeet on suunniteltava hyvin ja saadut tiedot on analysoitava huolellisesti. Tällöin on mahdollista saada diffuusiokerroin ja molekyylien liikkuvuusparametrit matemaattisen mallinnuksen avulla.