F-aktiini

Crystal Structure of F-actin, 2zwh

Filamenttista aktiiniä (F-aktiini) sisältäviä yksiköitä kutsutaan myös mikrofilamenteiksi, ja ne ovat erittäin konservoituneita, proteiinipitoisia komponentteja, joita löytyy eukaryoottisista sytoskeletoneista lähes ubiikkisesti. F-aktiinilla ja muilla aktiiniproteiineilla on yleensä rakenteellisia tehtäviä soluissa.

Johdanto

Aktiinia esiintyy lähes kaikissa eukaryoottisoluissa, ja se tunnetaan ensisijaisesti rakenteellisena ja translokaatioproteiinina. Sillä on myös ATPaasifunktio, sillä se hydrolysoi ATP:tä ADP:ksi ja Pi:ksi ja käy läpi konformaatiomuutoksia jokaisen hydrolyysin yhteydessä. Nukleotidiriippuvaisen konformaatiomuutoksensa vuoksi aktiini kuuluu aktiinin superperheeseen, johon kuuluu myös muita proteiineja, kuten Hsp70(DnaK), Hsc70 ja heksokinaasi. Escherichia colin, Hsc70:n ja aktiinin ATPaasidomeenin havaitun samankaltaisuuden vuoksi uskotaan, että näillä kahdella proteiinilla on yhteinen syntyperä. Prokaryooteilla ei tiedetä olevan aktiinia, mutta niillä on kuitenkin aktiinin homologi, MreB, mikä myös johtaa ajatukseen mahdollisesta yhteisestä esi-isästä.

Aktiinia esiintyy kahdessa muodossa: globulaarisena aktiinina (G-aktiini), joka on aktiinin vapaita monomeeriyksiköitä, ja filamenttisena aktiinina (F-aktiini), joka on polymeerimuoto. Nämä kaksi muotoa ovat dynaamisessa tasapainossa keskenään, sillä ATP:hen liittyvä polymerisaatio ja depolymerisaatio tapahtuvat solussa jatkuvasti. F-aktiinin monomeeriyksiköillä on vapaasta monomeerimuodosta poikkeava muoto, ja tämän muutoksen seurauksena voidaan havaita spesifisempi ATP-aktiivisuus.

Kokoonpano

(1J6Z).

G-aktiini on aktiinin vapaa monomeerimuoto, joka polymerisoituu F-aktiiniksi. Globulaarisen ja filamenttisen aktiinin rakenteet eroavat toisistaan monin tavoin siitä huolimatta, että G-aktiini sisältää F-aktiiniä. Kun monomeerinen aktiini polymerisoituu F-aktiiniksi, yksikkö litistyy. F-aktiinilla on myös ATPaasifunktio, joka on minimaalinen G-aktiinissa. Domeenit ja aktiivinen alue ovat osatekijöiltään samat, ja niitä käsitellään myöhemmin F-aktiinin monomeerin osalta.

G-aktiinilla näyttää olevan rakenteessaan enemmän ligandeja aktiivisen alueen ulkopuolella. Vain 3:n viidestä uskotaan olevan todella olemassa liuoksessa, ja niiden uskotaan edistävän G-aktiinin polymerisaatiota F-aktiiniksi. Tässä G-aktiinin esityksessä on myös sellainen, joka on havaittu joissakin aktiinin kiderakenteissa, mutta ei välttämättä. Havaittua molekyyliä Cys374:ssä, käytettiin estämään polymerisaatioaktiivisuus, jotta G-aktiinin kide voitiin havainnoida

F-aktiinin muodostuminen on dynaaminen kokoonpano- ja purkamisprosessi, jota on kutsuttu ”treadmillingiksi”. Siirtyminen G-aktiinin ja F-aktiinin välillä alkaa ATP-aktiiniyksiköiden stabiloidusta oligomeerista, joka muodostuu nukleaatio-kondensaatiotyyppisen taittumismallin avulla. Tämän jälkeen ATP-monomerisia yksiköitä lisätään kumpaankin päähän, mutta koska molemmissa päissä on erilainen varauspolariteetti, lisäys tapahtuu mieluummin niin sanottuun ”plus (+) päähän” tai ”piikkipäähän”. Vastakkaiseen päähän, ”miinus (-) päähän” tai ”terävään päähän”, tapahtuu ensisijaisesti aktiiniyksiköiden dissosiaatio.

ATP:hen sitoutuneen aktiinin kiinnittymisen jälkeen tapahtuu ATP:n hydrolyysi, jolloin saadaan ADP:hen ja Pi:hen sitoutunut tila. Pi:n myöhempi häviäminen jättää ADP-aktiini-tilan. Koska monomeeriyksiköiden lisäys tai poisto voi tapahtua molemmissa päissä, F-aktiinin kokoonpanoa voidaan kuvata tasapainon avulla. Koska ATP-aktiinin assosioitumisnopeus on kuitenkin kymmenkertainen ADP-aktiinin dissosioitumisnopeuteen verrattuna, f-aktiini näyttää etenevän eteenpäin eli ”tallaavan”. ADP-aktiini-monomeerit dissosioituvat miinuspäässä ja kierrätetään ATP-aktiiniksi, jotta polymerisaatio plussapäässä voi jälleen tapahtua.

Rakenne

Rakenteen historiaa

F-aktiiniproteiinin löysi Straub vuonna 1942. Rakennetta spekuloitiin Holmesin et al. vuonna 1990 löytämän matalaresoluutioisen röntgenkristallografian perusteella ja tämän ajan kuluessa hyväksyttiin ”Holmesin malli”. Sen sijaan G-aktiinin rakenne on määritetty itsenäisesti yli 30 kertaa. Korkeamman resoluution F-aktiinimalli talletettiin PDB-tietopankkiin vasta hiljattain joulukuussa 2008 Oda et al. .

F-aktiinin monomeeri ja polymeeri

(2zwh)

Monomeeri

Kullakin F-aktiinin monomeeriyksiköllä on tertiäärirakenteeseensa kuuluvana useampia silmukoita, jotka ovat tärkeitä sen kokoonpanon kannalta polymeeriseksi F-aktiiniksi. Nämä silmukat kokevat konformaatiomuutoksia sidotun nukleotidin tilan perusteella tai ne toimivat alueina, joihin viereiset monomeeriset aktiiniyksiköt voivat sitoutua. Se toimii ”kytkimenä” konformaatioiden välillä sidotun nukleotidin perusteella. DNAse I:tä sitovan silmukan jäännökset (40-50) sen lisäksi, että ne kokevat stabiilisuuteen vaikuttavia konformaatiomuutoksia, sitovat DNAse I -entsyymejä, ja niiden oletetaan pitävän kiinni DNAse I:stä. Hydrofobinen silmukka , joka ulottuu jäännösten 264-273 välille, ja , joka ulottuu jäännösten 165-172 välille, toimivat paikkoina, joihin vierekkäiset aktiini-monomeerien D-silmukat voivat sitoutua. Samanlainen tehtävä on myös jäännöksillä (374-375).

Kuvassa esitetty F-aktiinimolekyyli koostuu 375 jäännöksestä(43kDa) ja kahdesta ligandista, ADP:stä ja Ca2+:sta. Sillä on kaksi päädomeenia, jotka erottaa toisistaan nukleotidia sitova halkio. Sitoutuneen nukleotidin tilasta riippuen F-aktiinin vakain konformaatio muuttuu. ATP:hen ja ADP + Pi -nukleotidiin sitoutuneissa tiloissa sillä on suljettu sitoutumishalkeama. Pelkästään ADP:hen sitoutuneessa tilassa sillä on leveämpi sitoutumishalkeamaAktinille ominainen piirre on, että domeenit pysyvät vääntyneinä toisiinsa nähden nukleotiditilasta riippuvista konformaatiomuutoksista huolimatta.

F-aktiinipolymeeri (perustuu Ken Holmesin F-aktiinirakenteeseen)

Polymeeri

F-aktiini näyttää kahdelta oikeakätiseltä helikseliltä, joilla on asteittainen kierre toistensa ympäri. Se koostuu todellisuudessa toistuvista 13 aktiiniyksiköstä jokaista kuutta vasenkätistä kierrosta kohden, ja sen pituus on 350 Å.

Nukleotidin tilasta riippuvat konformaatiomuutokset

Sitoutuneen fosforyloidun nukleotidin tila vaikuttaa siihen, millaisen konformaation F-aktiini-monomeeri ottaa. Gamma-fosfaatin läsnäolo aktiivisessa keskuksessa aiheuttaa Ser14-jäännöksen kiertymisen. Tämä muutos johtaa metyloituneen histidiinin (HIC73) siirtymiseen, mikä muuttaa F-aktiinin aktiivista aluetta ja aiheuttaa konformaatiomuutoksen D-silmukassa. HIC73 sijaitsee ”anturisilmukassa” eli ”kytkimessä”, joka yhdistää sidotun nukleotidin muutokset konformaatiomuutoksiin. ATP-aktiinissa ja ADP-Pi-aktinissa D-silmukka on jäsentymätön. F-aktiinin ADP:hen sitoutuneessa muodossa monomeerin D-silmukassa on yleisesti alfakierre.

Vaikka alfaheliksiä ei havaita tässä Odan F-aktiinin mallissa eikä eräissä muissakaan F-aktiini-tutkimuksissa, Oda et. al. myöntävät, että kokeelliset tulokset ovat voineet johtaa siihen, että mallissa on pidennetty alfaheliksi eikä pidennetty epäjärjestyksessä oleva säie F-aktiini-monomeerien välisenä vuorovaikutussegmenttinä.

Domainit

(2zwh)

F-aktiiniyksikön rakenne syntyy yhdestä polypeptidiketjusta, jossa on kaksi domainia. Kahden domeenin välissä voidaan havaita nukleotidia sitova halkio, ATP:n hydrolyysin paikka. Domeenien liike mahdollistaa avoimen ja suljetun F-aktiinin konformaatiot.

Domeenien liikkuminen mahdollistuu kiertymällä violetilla esitetyn ,:n ympäri. Oda et al. mukaan G-aktinista F-aktiniin siirryttäessä domeeni 2:n uskotaan kallistuvan 20° ja sovittuvan domeeni 1:n kanssa, jolloin muodostuu litteämpi konformaatio kuin vapaassa G-aktinissa. Ei ole varmaa, tapahtuuko tämä litistyminen ennen vai jälkeen ATP-hydrolyysin. Holmes tarjoaa yksinkertaistetun kuvan tästä domeenin liikkeestä ja litistymisestä.

Stabiilisuus

F-aktiinin litistetty taitettu muoto vaatii erilaisia stabilointimekanismeja kuin vapaa monomeerinen G-aktiini. F-aktiinikompleksin stabiliteetti saavutetaan sarjalla, johon osallistuvat arginiini 206, 183, 177 (violetti); glutamaatti 72 (sininen), aspartaatti 187 (vihreä), 179 ja 4-metyylihistidiini 73 (keltainen). Lisävakauden uskotaan johtuvan vuorovaikutuksen katkeamisesta jäännösten välisestä vuorovaikutuksesta, jotka ovat samassa puoliskossa omien domeeniensa välillä, uuteen vuorovaikutukseen, jossa niiden välillä havaitaan paljon suurempi etäisyys.

Kun pii vapautuu, D-silmukan konformaatiomuutos johtaa F-aktiinifilamentin ”pehmenemiseen”. Toisin sanoen se tekee ADP-aktiini-monomeerin epävakaammaksi ja alttiimmaksi pilkkoutumiselle

Aktiivinen paikka

Aktiinin sitoutuessa aktiinifilamentin plus-päähän ATPaasitoiminto aktivoituu. Konformaatiomuutos G-aktinista F-aktiniin edistää katalyyttistä aktiivisuutta, koska 20°:n siirtymä johtaa sulkeutuneempaan sitoutumiskohtaan; tätä konformaatiomuutosta vakauttaa myös Leu110:n ja Thr194:n välinen diagonaalinen osa-alueen vuorovaikutus. Näiden konformaatiomuutosten seurauksena aktiini siirtyy lähemmäs ATP-Ca2+-ligandia. Gln137:ssä on vesimolekyyli, ja sen sijoittaminen ATP:n läheisyyteen mahdollistaa gamma-fosfaatin pilkkoutumisen. Epäorgaanisen fosfaatin vapautuminen tapahtuu joustavan ”D-silmukan” konformaatiomuutoksen kautta järjestäytyneeksi alfahelixiksi (jota tämä malli ei tosin osoita).

Toiminta

F-aktinilla on rakenteellinen, mekaaninen ja entsymaattinen tehtävä eukaryoottisoluissa. Nämä toiminnot eivät välttämättä sulje pois toisiaan.

F-aktiinin dynaamiset toiminnot ovat vahvasti mukana solujen migraatiossa.

Sytoskeletti

F-aktiini on eukaryoottien sytoskeletin runsain komponentti. Se tarjoaa ohueen kokoonsa nähden suuren määrän vetolujuutta. Tapauksissa, joissa joustavuus ei ole toivottavaa rakennekomponenttina, F-aktiinipolymeerien välille voidaan muodostaa ristisidoksia, jotka antavat suuremman jäykkyyden ja tuen.

F-aktiinihaarojen pidentyminen johtaa ilmiöön, jossa plasmakalvo työntyy eteenpäin lamellopodiaalisessa ja filopodiaalisessa jatkeessa. Tämä prosessi perustuu dynaamiseen tasapainotilaan, jossa G- ja F-aktiini ovat, sillä kalvon pidennystä ajaa eteenpäin etureunan aktiiniyksiköiden jatkuva polymerisaatio. Ilman F-aktiinin entsymaattista ATPaasitoimintaa tämä prosessi ei olisi mahdollinen.

Aktiini-myosiini

F-aktiinin suhteellisen litteämpi muoto G-aktiiniin verrattuna mahdollistaa sen, että myosiini voi sitoutua mieluummin F-aktiiniin kuin G-aktiiniin. Tämä tarkoittaa, että F-aktiini, ei G-aktiini, on aktiinin toiminnallinen muoto. Se muodostaa suuren osan ohuista filamenteista yhdessä mysoiinin kanssa lihassupistusten aikaansaamiseksi. F-aktiinin rakenne antaa sille suuren vastustuskyvyn laajoja voimia vastaan, kuten lihassupistuksessa esiintyviä voimia vastaan.