EzColocalization:

Yleiskatsaus EzColocalization-työnkulkuun

EzColocalization-työnkulku on jaettu neljään moduuliin, joilla kullakin on oma välilehti käyttöliittymässä. Välilehdet ovat: (i) ”Syötteet”, jossa kuvat, maskit tai kiinnostavien alueiden (ROI) luettelot valitaan ja kohdistetaan; (ii) ”Solusuodattimet”, jossa solut voidaan valita fyysisten ominaisuuksien ja signaalin voimakkuuden perusteella; (iii) ”Visualisointi”, jossa luodaan lämpökarttoja, hajontakuvioita ja metriikkamatriiseja (määritelty jäljempänä); ja (iv) ”Analyysi”, jossa valitaan kolokalisaatiometriikat ja -ulosteet. Kaikkia moduuleja eikä kaikkia prosesseja moduulin sisällä tarvitse käyttää. Joillakin välilehdillä on ”Esikatselu”-painike tietyn moduulin suorittamiseksi ”Analysoi”-painikkeen sijaan, joka suorittaa kaikki valitut prosessit kaikissa moduuleissa.

Syötteet

Kuvatiedostojen, jotka valitaan ”Syötteet”-välilehdellä (kuva 1A), on oltava: (i) yksivärisiä (eli ei RGB- tai CMYK-muodossa), ii) 8-bittisiä, 16-bittisiä tai 32-bittisiä ja iii) sellaisessa muodossa, kuten TIFF-muodossa, jossa säilytetään pikselien alkuperäiset intensiteettiarvot. Suuret kuvat voidaan pakata tiedostojen siirtoa varten käyttämällä häviötöntä muotoa, kuten ZIP tai LZW, ja purkaa sitten analyysejä varten. Kuvien lisäksi EzColocalization voi hyväksyä maskit ja ROI-luettelot solujen tunnistamista varten (ks. jäljempänä). Jos jokaisesta kanavasta on useita kuvia, kuvat on pinottava tehokkaampaa analysointia varten ”Stack”-valikossa (katso lisätietoja ImageJ-oppaasta24). Pinossa olevat kuvat voivat olla eri näkökenttiä tai aikasarjoja, mutta niillä on oltava samat mitat, suurennos ja kuvajärjestys kunkin kanavan osalta. Syöttö-välilehdellä on myös vaihtoehtoja signaalin voimakkuuden kynnysarvojen asettamiseen ja eri kanavien väärin kohdistettujen kuvien kohdistamiseen (kuva 1B ja lisätiedot). Suosituksia sopivien kuvien hankkimiseksi kolokalisaatioanalyysiä varten annetaan lisätiedoissa. Huomautus: Kohdistus toimii olettaen, että signaalin intensiteetille voidaan valita sopiva kynnysarvo, jonka avulla voidaan erottaa pikselit solujen sisällä ja ulkopuolella; jos kynnysarvo sisältää solun ulkopuolisia alueita tai vain rajoitetun alueen solujen sisällä, kohdistus ei välttämättä toimi oikein. Tästä syystä kaikki kohdistukset on tarkistettava visuaalisesti tarkastelemalla ROI:ita sen varmistamiseksi, että sopivat solualueet on valittu.

EzColocalization on ensisijaisesti suunniteltu yhdelle ”solujen tunnistus”-kanavalle ja kahdelle tai kolmelle ”reportteri”-kanavakuvalle. Se voi kuitenkin toimia myös muilla syöttöyhdistelmillä (taulukko S1). Solujen tunnistuskanavaa käytetään yksittäisten solujen tunnistamiseen ja näin ollen solunsisäisten ja solunulkoisten pikselien erottamiseen. Solujen tunnistuskanava voi olla mikä tahansa kuvatyyppi, joka mahdollistaa solujen rajojen tunnistamisen, mukaan lukien: valomikroskopiakuvat (esim. faasikontrasti25,26 ja kirkkauskenttä), kuvat, joissa on solukalvoa tai koko sytoplasmaa merkitsevä reportteri (esim. Cy5, kuva 1B), ja kuvat, joissa on solunulkoista väriainetta, joka hahmottaa soluja. DIC-kuvat (differentiaalinen interferenssikontrasti) luovat varjoja, jotka vaikeuttavat solujen automaattista valintaa kynnysarvomenetelmillä27 ; siksi DIC-kuvien osalta suosittelemme, että ROI:t luodaan käyttämällä ImageJ:n ”valintatyökaluja” solualueiden hahmottamiseksi manuaalisesti ja niiden lisäämiseksi luetteloon valitsemalla ”Add to Manager” (valikossa ”Selection” (Valinta) ”Edit” (Muokkaa) -valikon alivalikossa). Kun kuvan kaikkien kiinnostavien solujen ROI:t on valittu, voidaan luoda binäärinen maski ImageJ:n ”Clear Outside”- ja ”Autothreshold”-toiminnoilla.

Cell Filters

Välilehteä ”Cell Filters” (solusuodattimet) käytetään apuna solujen valitsemisessa kuvista (kuva 2A) ja solunsisäisten ja solunulkoisten pikseleiden erottamisessa. Solut tunnistetaan seuraavasti: (i) valitsemalla jokin ImageJ:n kynnysalgoritmeista24 tai valitsemalla kynnykset manuaalisesti (mikä tehdään valitsemalla ”*Manual*” Inputs-välilehden pudotusvalikosta ja painamalla ”Show threshold(s)” -painiketta) solujen tunnistuskanavan soluja vastaavien alueiden tunnistamiseksi (Kuva. 2B); ii) vedenjakajan segmentoinnin käyttäminen koskettavien kohteiden erottamiseksi solutunnistuskanavan kuvista (valinnainen) (kuva 2B); iii) kohteiden valitseminen solutunnistuskanavan kuvista fyysisten parametrien (kuva 2C) ja signaalin voimakkuuden (kuva 2D) perusteella. EzColocalization pyrkii automaattisesti havaitsemaan, onko syöttökuvissa tumma vai vaalea tausta, käyttämällä vinoutta. Olettaen, että taustalla on enemmän pikseleitä kuin soluissa, kuva, jossa on positiivinen vinous, osoittaa tummaa taustaa ja negatiivinen vinous osoittaa vaaleaa taustaa. Käyttäjät voivat myös manuaalisesti valita ”Asetukset”-valikon ”Parametrit…”-vaihtoehdoissa, onko syöttökuvilla tumma vai vaalea tausta. Sellaiset solut, jotka ovat vain osittain kuvan sisällä ja voisivat siksi antaa harhaanjohtavia arvoja, poistetaan automaattisesti analyyseistä.

EzColocalizationissa on yksi valinnainen ”Pre-watershed-suodatin” ja kahdeksan valinnaista post-watershed-suodatinta (ja mahdollisuus valita lisää). Watershed-segmentointi voi auttaa jakautuvien ja koskettavien solujen erottamisessa28 , mutta se voi myös jakaa suuria kohteita, kuten solunulkoisen materiaalin aggregaatteja, pienempiin fragmentteihin, jotka ovat samankokoisia kuin solut. Jälkimmäisen välttämiseksi voidaan Pre-watershed-suodatinta käyttää jättämään analyysin ulkopuolelle kohteet, joiden pinta-ala on suuri. Cell Filters (Solusuodattimet) -välilehden Preview (Esikatselu) -painikkeen avulla käyttäjät voivat nähdä, mitkä nykyisen kuvan objektit valitaan, kun kaikkien suodattimien minimi- ja maksimirajat on säädetty. Vesipiirin jälkeisiä solusuodattimia varten on kaksi parametriluokkaa (taulukko S2): (i) fysikaaliset parametrit, jotka perustuvat solujen tunnistuskanavan mittauksiin, ja (ii) signaalin intensiteettiparametrit reportterikanavista. Fyysisiä parametreja sovelletaan kaikkiin kanaviin, kun taas signaalin voimakkuusparametreja sovelletaan vain siihen reportterikanavaan, jolle ne on valittu (koska reporttereilla voi olla hyvin erilaisia signaalitasoja). ImageJ:n esiasetettuihin vaihtoehtoihin perustuvan suodatuksen lisäksi EzColocalizationissa on suodattimet ”MeanBgndRatio” tai ”MedianBgndRatio” -arvoille, jotka lasketaan jakamalla objektin sisällä olevien pikseleiden signaalin intensiteetin keskiarvo tai mediaani kohteen sisällä olevien pikseleiden signaalin intensiteetin keskiarvolla tai mediaanilla solun ulkopuolisten pikseleiden signaalin intensiteetin vastaavalla keskiarvolla tai mediaanilla.

Visualisointi

Välilehdellä ”Visualisointi” näytetään solujen signaaleja tai metriikoita muodossa: (i) ”lämpökarttoina”, (ii) hajontakuvioina ja (iii) ”metriikkamatriiseina” (Kuva 3A).

Lämpökartat ovat pseudovärikuvia, jotka näyttävät reportterisignaalien suhteellisen suuruuden (Kuva 3B). Ne luodaan normalisoimalla ja skaalaamalla uudelleen siten, että pikselien minimi- ja maksimiarvot ovat 0 ja 255 kussakin solussa, kuvassa tai pinossa. Lämpökarttojen väritysvaihtoehtoja on kahdeksan, ja kunkin värin intensiteettiarvot saadaan ”Show LUT”-toiminnolla (ImageJ:n ”Image”-valikon ”Color”-alavalikossa). Solujen lämpökartat soveltuvat sen määrittämiseen, missä kukin reportteri esiintyy suurimmalla intensiteetillä soluissa. Kuvan lämpökartat voivat osoittaa, jos eri solujen intensiteetit näkymäkentän sisällä eroavat huomattavasti toisistaan, mikä voi viitata biologiseen heterogeenisuuteen tai merkinnän epätasaisuuteen. Pinon lämpökartat voivat osoittaa, jos eri kuvissa olevilla soluilla on olennaisesti erilaiset signaalin intensiteettitasot, mikä voi viitata epätasaisuuteen leimauksessa tai mittauksissa eri puolilla objektilasia (esim. fotovärjäytymisestä johtuen) tai signaalin muutoksiin ajan kuluessa (jos pino on aikasarja). Huomautus: kirkkaus- ja kontrastiasetukset vaikuttavat lämpökartan ulkoasuun.

Scatterplotit osoittavat yksittäisten solujen ja kuvien kahden tai kolmen reportterikanavan signaalin voimakkuuden välisen suhteen (kuva 3C). Tämä suhde on tärkeä valittaessa sopivaa kolokalisaatiometriikkaa (täydentävät tiedot). Hajontakaaviot voivat myös paljastaa lokalisaatiokuvioiden heterogeenisuuden8 , mikä voi vaatia taustapikselien poistamista tai erillisiä analyysejä eri solutyypeille.

Mittarimatriisit antavat yleiskuvan lokalisaatiokuvioista näyttämällä kolokalisaatiometriikan lasketut arvot monille kynnysarvoyhdistelmille. Kynnyksen päällekkäisyyspistemäärän (threshold overlap score, TOS) metriikkamatriisit ovat osoittautuneet hyödyllisiksi kahden reportterikanavan lokalisaatiokuvioiden analysoinnissa8,15 (kuva 3D). Täydellisyyden vuoksi EzColocalization-ohjelmassa on mahdollisuus laskea metriikkamatriisit kahdelle reportterikanavalle käyttäen viittä muuta metriikkaa: kynnyksen päällekkäisyyspistemäärää logaritmisella skaalauksella8, Pearsonin korrelaatiokerrointa (PCC), Mandersin kolokalisaatiokertoimia (M1 ja M2), Spearmanin korrelaatiokerrointa (SRCC) ja intensiteettikorrelaatiokertoimen kertoimia (ICQ)8,15. Kolokalisaatiota kolmen kanavan osalta voidaan mitata myös ICQ:n, Mandersin kolokalisaatiokertoimien ja TOS:n29 avulla (lisätiedot).

Kynnysarvot kaikille mittareille mitataan signaalin intensiteetin pikseleiden ylimpänä prosenttipisteenä (FT)8,15. Esimerkiksi FT = 0,1 on 10 % pikseleistä, joilla on korkein signaali. Mittarimatriiseissa FT:tä käytetään myös kynnysarvoyhdistelmien askelkoon määrittämiseen. Toisin sanoen FT = 0,1 valitsee myös kynnysarvot 10 %:lle, 20 %:lle, … ja 100 %:lle pikseleistä, joiden signaali on korkein. Jos FT ei jaa tasan 100:lla, jäljelle jäävä prosentti on viimeinen askelkoko. Niiden mittareiden osalta, jotka eivät tarvitse kynnysarvoa (eli PCC, SRCC ja ICQ), arvot lasketaan olettaen, että vain kynnysarvojen yläpuolella olevat pikselit ovat olemassa. Metriikkamatriisi-ikkunassa on vaihtoehtoja tulosten tallentamiseksi tekstinä tai kuvana, FT:n tai metriikkatyypin muuttamiseksi, yksittäisten solujen metriikka-arvojen tarkastelemiseksi luettelona ja metriikan keskiarvon, mediaanin tai moodin laskemiseksi kullekin kynnysarvoyhdistelmälle. ”Proc”- (käsitelty) ja ”Raw”-painikkeilla määritetään, onko näytetty, kopioitu tai tallennettu ”List”-, ”Copy”- tai ”Save…”-painikkeilla näytetty, kopioitu tai tallennettu tietoluettelo vastaavasti näytteen keskiarvo kullekin kynnysarvoyhdistelmälle (esim. mediaaniarvo) vai kaikki arvot kullekin näytteen solulle kaikille kynnysarvoyhdistelmille.

Analyysi

Välilehdellä ”Analyysi” (Analysis)

analyysi

”Analysis”

Välilehti on varustettu kolmella alavälilehdellä (Analyysi-, Analyysin mitat, Mittaus-, Analysointitiedot- ja Mukautetut-). Analysis Metrics -alivälilehdellä on kuusi metriikkaa kolokalisaation mittaamiseen kahdelle raportoijalle (kuva 4A) ja kolme metriikkaa kolmelle raportoijalle (ks. edellinen jakso). Käyttäjät voivat valita kynnysarvon tai ei kynnysarvoa PCC:lle, SRCC:lle ja ICQ:lle. TOS- ja Mandersin kolokalisaatiokertoimilla on oltava kynnysarvo, jotta ne voidaan laskea. Metrics Info -alivälilehti sisältää tietoja ja resursseja Analysis Metrics -alivälilehdessä käytetyistä metriikoista (lisätietoja lisätiedoissa). Kynnysarvot voidaan valita Costesin menetelmällä30 tai manuaalisesti. Custom-alivälilehdessä (lisätietoja on lisätiedoissa) käyttäjät voivat kirjoittaa omaa JavaTM -koodia kuvien analysoimiseksi (huomautus: annettu esimerkki koskee PCC:n laskemista) (kuva 4B). ”Compile”-painike testaa koodin ja luo väliaikaisen tiedoston Javan väliaikaiseen hakemistoon ja näyttää kääntämisen tuloksen ”Succeeded”- tai ”Failed”-merkinnällä. Jos kääntäminen onnistuu, käännetty mukautettu koodi luetaan uudelleen muistiin ja sitä sovelletaan valittuihin soluihin.

Kunkin analyysin tuloksena on taulukko, jossa määritetään kuva ja tunnistenumero jokaiselle solulle (kuva 4C), ja kullekin solulle annetaan arvot seuraaville arvoille (i) valittu metriikka; (ii) fyysiset parametrit; ja (iii) keskimääräinen signaalin voimakkuus jokaiselle kanavalle (jos valittu). Huomautus: ”NaN” tulostaulukossa tarkoittaa, että arvoa ei ole onnistuttu laskemaan. Käyttäjät voivat myös luoda yhteenveto-ikkunoita (joissa on solujen lukumäärä, keskiarvo, mediaani ja keskihajonta valitun metriikan osalta) (kuva 4D), metriikka-arvojen histogrammeja (kuva 4E), binäärimaskikuvia ja luettelon ROI-alueita, jotka edustavat kunkin solun sijaintia ja numeroa kussakin kuvassa ROI-hallinnassa. ROI-luettelot ja binäärimaskikuvat voidaan tallentaa samojen solujen uudelleen analysointia varten.

EzColocalizationin sovellukset

EzColocalization on suunniteltu käytettäväksi modulaarisesti, mikä helpottaa analyysien räätälöintiä monenlaisiin kokeisiin ja tutkijan tarpeisiin. Tässä osiossa keskitytään EzColocalizationin erityistyökalujen demonstrointiin todellisten ongelmien ratkaisemiseksi erilaisissa kuva-aineistoissa.

Esimmäisessä EzColocalizationin sovelluksessa demonstroidaan kuvia rotan hippokampuksen neuroneista Cell Image Librarysta (CIL:8773, 8775-8788, jotka on omistettu Dieter Brandnerille ja Ginger Withersille): (i) reportterikanavan käyttöä solujen tunnistamiseen, kun kokeessa ei ole erillisiä muita kuin reportterikuvia solujen tunnistamista varten; (ii) solusuodattimia solujen valitsemiseksi; ja (iii) visualisointityökaluja metriikoiden valitsemiseksi. Analyysin työnkulku on esitetty kuvassa 5A. Ensimmäisessä vaiheessa luotiin kaksi reportterikuvapinoa: toinen pino, jossa on kuvia, joissa F-aktiini on leimattu (käyttäen rhodamiiniin konjugoitua falloidiinipeptidiä), ja toinen pino, jossa on kuvia, joissa tubuliini on leimattu (käyttäen Alexa 488:aan konjugoitua vasta-ainetta) (kuva 5B). F-aktiinin ja tubuliinin vuorovaikutus on tärkeää neuronien kasvun ja migraation kannalta31,32. Käytimme F-aktiinikuvia solujen tunnistamiseen, koska sitä esiintyy kaikissa soluissa ja se osoittaa solujen rajat8. Yksittäiset solut valittiin F-aktiinikuvista soveltamalla kynnysarvoa solujen tunnistamiseksi24 ja käyttämällä solusuodatinta solujätteen poistamiseksi (huom. parametriarvot kuvassa 5A).

Solujen valinnan jälkeen reportterisignaalien intensiteettiä tarkasteltiin solujen lämpökarttojen ja hajontakuvien avulla. Havaitsimme, että reportterit eivät kolokalisoituneet korkeilla signaalitasoilla ja signaalien intensiteettien välillä oli monimutkainen suhde (Kuva 5C,D). Jälkimmäisen vuoksi lokalisaatio kvantifioitiin käyttämällä Mandersin M1- ja M2- ja TOS-arvoja (täydentävät tiedot). M1 ja M2 arvioitiin Costesin menetelmällä valituilla kynnysarvoilla kuvassa 5B hahmotellulle solulle, ja arvot olivat vastaavasti 0,289 ja 0,995. Nämä arvot tulkitaan yleensä osoittavan, että tubuliinilla on korkea kolokalisaatio F-aktiinin kanssa ja F-aktiinilla on matala kolokalisaatio tubuliinin kanssa. TOS-arvoja arvioitiin luomalla metrinen matriisi, jossa oli TOS-arvojen mediaanit. Matriisi osoitti kolokalisaation, antikolokalisaation ja ei-kolokalisaation eri kynnysarvoilla tubuliinin ja F-aktiinin signaalin intensiteeteille (kuva 5E). Niissä solujen kohdissa, joissa F-aktiini- ja tubuliinisignaalin intensiteetti on korkein (10 % pikseleistä kunkin kanavan osalta), TOS-arvon mediaani on -0,36 (n = 20). Tämä negatiivinen arvo viittaa antikolokalisaatioon, mikä on yhdenmukainen lämpökartoista ja hajontakuvioista saadun vaikutelman ja muiden raporttien8 kanssa.

Toisessa sovelluksessa Cell Image Library33:sta saatiin kuvia mitoosia läpikäyvästä Saccharomyces cerevisiae -bakteerista sen osoittamiseksi: (i) solujen tunnistaminen käsin piirrettyjen ääriviivojen avulla (kokeissa, joissa ei voida käyttää automaattisia solujen tunnistamismenetelmiä) ja ii) kuvien kohdistaminen. Raportoijien syötteet olivat kuva villityyppisestä kannasta (”kontrolli”; CIL: 13871), jossa on BFA1-proteiini, joka lataa TEM1:n karan naparunkoon, ja kuva kannasta, jossa ei ole BFA1-proteiinia (∆bfa1-deleetio-mutantti; CIL: 13870). Näissä reportterikuvissa solut ekspressoivat TEM1-proteiinia, joka oli fuusioitu GFP:hen, ja DNA oli merkitty DAPI:lla (4′, 6-diamidino-2-fenylindoli). TEM1 lokalisoituu mitoosin aikana karan napakappaleisiin, ja se osallistuu mitoosista poistumisen käynnistämiseen33. Työnkulku on esitetty kuvassa 6A. Tässä sovelluksessa ROI:t piirrettiin manuaalisesti solujen ympärille käyttämällä ImageJ:n ”Freehand”-valintatyökalua DIC-kuviin. Binäärimaskit, joita käytettiin solualueiden valintaan, luotiin valitsemalla ROI:t ja käyttämällä ImageJ:n ”Clear Outside” ja sitten ”Auto Threshold” -toimintoja24 (kuva 6B). Solualueita käytettiin solujen tunnistamiseen ja DIC-kuvien ja reportterikanavien välisen kohdistuksen korjaamiseen käyttämällä ”Default”-kynnysalgoritmia (kuva 6C). Tämän solujen tunnistamisen ja kuvien kohdistamisen jälkeen kuvat ovat nyt valmiita visualisoitaviksi ja analysoitaviksi edellisessä esimerkissä kuvatulla tavalla.

Kolmannessa sovelluksessa käytettiin Broad Bioimage Benchmark Collectionista (BBBC012v1, M14)34 saatuja kuvia kokonaisista aikuisista Caenorhabditis elegans -eläimistä: (i) EzColocalization voi analysoida kolokalisaatiota kokonaisissa organismeissa; ja (ii) ”solu”-suodattimilla voidaan valita yksittäisiä organismeja reportterisignaalin voimakkuuden perusteella. Tämän esimerkin kuvat ovat samasta tietokokonaisuudesta, jota käytettiin TOS:ää kuvaavassa tutkimuksessamme (mutta ne eivät ole samoja kuvia)8. Työnkulku on esitetty kuvassa 7A. Yksittäisten C. eleganien ääriviivat piirrettiin ImageJ:ssä kirkkaankenttäkuviin ROI:iden luomiseksi, ja ROI:t lisättiin ROI-manageriin ”solun” tunnistamista varten. Clec-60-promoottorista etusuolessa ilmaistu GFP oli reportteri 1 ja myo-2-promoottorista nielussa, joka on etusuolen vieressä oleva elin35 , ilmaistu mCherry oli reportteri 2. Fyysisten parametrien solusuodattimet olivat tarpeettomia, koska niiden ympärille oli alun perin piirretty ääriviivat vain niiden kohteiden osalta, jotka katsottiin sopiviksi C. elegans -eläimiksi. Signaalin voimakkuutta koskevat solusuodattimet olivat kuitenkin tarpeen, koska joillakin C. elegans -eläimillä oli alhainen GFP-signaali, mikä saattoi johtua siirtogeenin vaimentamisesta36,37 (kuva 7B). Myöhempi visualisointi ja analyysi voidaan suorittaa ensimmäisessä sovelluksessa kuvatulla tavalla.

Viidennessä sovelluksessa osoitamme kolokalisaation analyysin kolmelle reportterikanavalle. Työnkulku oli sama kuin kahdelle reportterikanavalle, paitsi että ”3 reportterikanavaa” valittiin ensin ”Asetukset”-päävalikossa (Kuva 8A). Kuvat saatiin Broad Bioimage Benchmark Collectionista (BBBC025, versio 1, Image set: 37983, kuva: p23_s9) U2OS-luusyöpäsoluista (n = 66)38. Kolmessa reportterikuvassa DNA, endoplasminen retikulum (ER) ja mitokondriot oli vastaavasti värjätty Hoechst 33342:lla, konkanavaliini A/Alexa Fluor488 -konjugaatilla ja MitoTracker Deep Red -värjäyksellä (ylempi rivi, kuva 8B). Solujen tunnistaminen suoritettiin vehnänalkioagglutiniinilla (WGA)/Alexa Fluor 555 -konjugaatilla leimatun plasmakalvon kuvan avulla (vasen yläkulma, kuva 8B). Huomaa: kuvaan oli merkitty myös Golgi-laite ja F-aktiini-verkosto38. Plasmakalvo jäljitettiin ImageJ:n monikulmioiden valintatyökalulla yksittäisten solujen ROI:iden luomiseksi, ja ROI:t sisältävä ROI-hallinta valittiin solujen tunnistamista varten.

Lokalisaatiokuviot visualisoitiin samalla tavalla kuin kahdella reportterilla, paitsi että: (i) raportoijien lämpökarttoja on kolme sarjaa kahden sijasta (alempi rivi, kuva 8B); ja (ii) hajontakuviot ja metriikkamatriisit ovat kolmiulotteisia (kuvat 8C-F). Visualisointi-välilehdellä ja Analyysi-välilehdellä (kuva 8G) on mahdollisuus mitata kolokalisaatiota kolmelle raportoijalle käyttäen ICQ-, TOS- tai Mandersin M1-, M2- ja M3-mittareita. Näistä kolmesta metriikasta TOS oli mielestämme helpoin tulkita. TOS:llä on yksi arvo kaikkien kolmen reportterisignaalin kolokalisaation mittaamiseksi, ja se osoitti selvästi, että ytimen, mitokondrioiden ja ER:n reportterisignaalit limittyivät toisiinsa matalilla kynnysarvoilla (eli korkeilla FT-arvoilla on kolokalisaatiota; punainen väri kuvassa 8E) ja eivät limittyneet toisiinsa korkeilla kynnysarvoilla (eli matalilla FT-arvoilla on antikolokalisaatiota; sininen väri kuvassa 8E). Nämä havainnot ovat sopusoinnussa sen kanssa, että tuma, mitokondriot ja ER-organellit limittyvät reunoillaan (jossa niiden raportoijien signaali on tyypillisesti alhaisempi) tunnettujen fysikaalisten vuorovaikutussuhteiden vuoksi, mutta eivät keskipisteissään (jossa niiden raportoijien signaali on tyypillisesti korkeampi), koska ne ovat erillisiä rakenteita soluissa39,40,41.