Evolutionary analysis of gyrA gene from Neisseria meningitidis bacterial strains of clonal complex 4821 collected in China between 1978 and 2016

N.meningitidis-kannoista

Seitsemänkymmentäseitsemän de novo gyrA-sekvenssiä CC4821 N.meningitidis -kannoista analysoitiin 149 julkisesti saatavilla olevan gyrA-sekvenssin yhteydessä (lueteltu lisätaulukossa 1). Tuloksena saadusta 226 gyrA-nukleotidisekvenssiä sisältävästä aineistosta muodostettiin naapuriliitos-fylogeneettinen puu (kuva 1). Samanlainen puu saatiin maksimikelpoisuusmenetelmällä (ML) (lisäkuva 1). Nukleotidisekvenssit poikkesivat merkittävästi toisistaan p-etäisyyden ollessa 0,045 (taulukko 1). Puun yleiskatsaus osoitti, että CC4821 N.meningitidis-kannoista peräisin olevat sekvenssit (kuvassa 1 punaisella) löytyivät koko puun pituudelta, mikä osoittaa, että gyrA-geeni oli suhteellisen divergentti näiden kantojen sisällä.

Neisseria-kannoista peräisin olevien 226 gyrA-geenin 226:n eri geenisekvenssin naapuriyhdistelmästä koostuva filogeneettinen puu. Kannan nimi on merkitty seuraavasti: lajin nimi-GB ID-kannan ID-ST-CC-Seroryhmä-keräysmaa-keräysvuosi-keräysvuosi-CIP-resistenssifenotyyppi. Puuttuvat tiedot on merkitty tyhjällä välilyönnillä. Esimerkiksi N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Saksa-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Etelä-Korea-2017. CC4821 N.meningitidis-kantojen sekvenssinimet on merkitty punaisella fontilla. Tässä tutkimuksessa tuotetut 77 sekvenssiä on alleviivattu. Yhdeksän referenssikannan sekvenssit on merkitty mustalla pisteellä. Bootstrap-arvot > 70 % on merkitty. Bootstrap-arvot < 70 % ilmoitetaan tarvittaessa suluissa. Tässä tutkimuksessa tunnistetut 9 geneettistä ryhmää on merkitty suluissa olevilla pystysuorilla viivoilla. CIP-resistenssi-fenotyyppi on merkitty merkinnöillä: R tarkoittaa resistenssiä, S herkkyyttä ja I välimuotoista resistenssi-fenotyyppiä

Kuusi 226 analysoidusta sekvenssistä lähes 62 % sekvensseistä (140 kappaletta) löytyi puun latvasta ilman merkitseviä bootstrap-arvoja (kuva 1). Nämä sekvenssit olivat erittäin homogeenisia, ja niiden p-etäisyys oli 0,003 (taulukko 1). Loput 86 sekvenssiä poikkesivat toisistaan enemmän, ja niiden p-etäisyys oli 0,066 suhteessa puun huipulle ryhmiteltyihin sekvensseihin. Useimpien näitä 86 sekvenssiä koskevien solmujen bootstrap-arvo oli > 70 %. Lisäksi p-etäisyys tämän 86 sekvenssin ryhmän sisällä oli 0,09, mikä osoittaa, että nämä sekvenssit olivat keskenään hyvin erilaisia. Koska puun suurimpien solmujen bootstrap-arvo oli > 80 %, päätimme jakaa sekvenssit mielivaltaisesti yhdeksään eri geneettiseen ryhmään (kuva 1; taulukko 1). Nämä 9 ryhmää löytyivät myös ML-puusta (lisäkuva 1). CC4821-kantojen gyrA-sekvenssit löytyivät kuudesta näistä geneettisistä ryhmistä, nimittäin ryhmistä 1, 2, 3, 5, 6 ja 8.

Ryhmä 1 koostui kahdesta sekvenssistä, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 ja N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Tätä ryhmää tuki 100 prosentin bootstrap-arvo, joka viittaa siihen, että nämä kaksi sekvenssiä erosivat suuresti muista sekvensseistä. Sekvensseillä oli 7 yhteistä aminomuutosta (taulukko 1, lisätaulukko 2). Pitkä haara, joka vastasi N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009-sekvenssiä, viittasi kuitenkin siihen, että myös tämä sekvenssi poikkesi merkittävästi N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005-sekvenssistä, ja tämä vahvistettiin näiden kahden sekvenssin välisellä p-etäisyydellä, joka oli 0,06 (taulukko 1).

Ryhmään 2 kuului kaksi sekvenssiä, jotka olivat peräisin seuraavista lajeista: n. meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005.meningitidis-kannoista, jotka kerättiin Gansun ja Guangxin maakunnissa Kiinassa vuosina 2007 ja 2011, nimittäin N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R ja N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Ryhmä 3 koostui yhdestä sekvenssistä, nimittäin N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Tätä sekvenssiä vastaava solmu sai 80 prosentin bootstrap-arvon. Lisäksi pienin pareittainen p-etäisyys tämän sekvenssin ja muiden analysoitujen sekvenssien välillä oli 0,032, mikä osoittaa, että tämä sekvenssi poikkesi merkittävästi muista analysoiduista sekvensseistä (taulukko 1).

Ryhmä 5 koostui 26 sekvenssistä, jotka olivat pääasiassa N.meningitidis-sekvenssejä, mukaan lukien 9 sekvenssiä, jotka olivat peräisin CC4821:stä. Seitsemän sekvenssin alaryhmä, jota tuki 100 prosentin bootstrap, sisälsi viisi sekvenssiä N.lactamicasta. Mielenkiintoista oli, että N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 klusteroitui N.lactamica-sekvenssien kanssa 100 %:n bootstrap-tuella ja pitkällä haaralla.

Ryhmä 6 koostui 27 sekvenssistä N.meningitidis-sekvenssistä (8 CC4821:stä) ja yhdestä N.cinerea-sekvenssistä, nimittäin N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, joka jakoi solmun N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R:n kanssa. N.cinerea-sekvenssissä oli kuitenkin pitkä haara, mikä viittaa merkittävään eroavaisuuteen N.meningitidis-sekvenssiin verrattuna. Käytettävissä olevien tietojen perusteella ryhmän 6 sekvenssit näyttivät olevan peräisin kannoista, jotka olivat resistenttejä CIP:lle. Näillä kannoilla ei kuitenkaan ollut yhteistä aminohapposubstituutiota, mikä viittaa siihen, että näiden kantojen resistenssifenotyypille ei ollut yhteistä markkeria (lisätaulukko 2).

Ryhmä 8 sisälsi suurimman osan (64 %) tässä raportissa analysoiduista N.meningitidis-sekvensseistä. Kannat oli kerätty viimeisten 88 vuoden aikana 13 eri maassa neljältä mantereelta. Huolimatta merkittävästä aikavälistä ja maantieteellisestä levinneisyydestä nämä sekvenssit olivat erittäin konservoituneita, ja p-etäisyys oli 0,003. Lisäksi nämä sekvenssit olivat peräisin 68 ST-kannan, 24 CC-kannan ja 9 seroryhmän kannoista, mukaan lukien referenssikanta 053442. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot osoittivat, että gyrA-geeni oli erittäin konservoitunut useimmissa N.meningitidis-kannoissa erilaisista geneettisistä ominaisuuksista, maantieteellisistä sijainneista tai keräysajasta huolimatta.

GyrA-proteiinin sisäisen eroavaisuuden analyysi

GyrA-proteiinin sisäistä aminohappojen eroavaisuutta analysoitiin 129:stä yksilöllisestä sekvenssistä (lisätaulukko 2). Kohdistuksessa esiintyneiden 931 aminohapon joukosta tunnistettiin kaksisataa viisikymmentäseitsemän erilaista paikkaa (kuva 2). Vaikka näitä kohtia löytyi eri puolilta proteiinia, eroavaisuuksien jakautuminen ei näyttänyt olevan satunnaista. Itse asiassa kaksi aluetta oli erittäin konservoitunutta, positiot 530-620 ja pienempi alue 300-330 välillä. E.coli-proteiinin mukaan ensimmäinen alue vastaa aminoterminaalisen domainin loppua ja karboksiterminaalisen domainin alkua. Toinen alue vastaa proteiinin tornidomeenia 3D-mallirakenteen perusteella (kuva 2).

GyrA-proteiinien välinen aminohappojen eroavaisuus 129 ainutlaatuisen sekvenssin perusteella. Sijainnit 932 aminohapon pituisessa kohdistuksessa on merkitty X-akselilla. Y-akselilla (vasemmalla) on merkitty niiden sekvenssien prosenttiosuus, joissa on tietty poikkeava asema. Esimerkiksi 58 prosentissa sekvensseistä on mutaatio kohdassa 91. Divergenssikuvio luotiin lisätaulukossa 2 esitetystä aminohappojen erotustaulukosta. Kohdistuksessa on 10 aukkoa, ja niiden sekvenssien lukumäärä, joissa on aukkoja, on merkitty oikealle akselille ja esitetty mustana neliönä. Vertailun vuoksi alareunassa on esitetty E.coli GyrA -proteiinin kartta, jossa on rakenteellisia ja toiminnallisia alueita. Kartta on luotu seuraavien viitteiden perusteella. E.colin ja N.meningitidis-referenssikannan 053442 (GB-ID CP000381) GyrA-proteiinisekvenssiä verrattiin (lisätaulukko 4). E.colin tunnetut CIP-resistentit kohdat on esitetty, ja N.meningitidiksen vastaavat kohdat on merkitty sinisellä viivalla. On syytä huomata, että E.colista ilmoitetuista kahdeksasta resistentistä kohdasta vain paikat 83 ja 87 poikkeavat toisistaan N.meningitidiksessä (paikat 91 ja 95)

257:stä poikkeavasta kohdasta yksikään ei ollut yhteinen kaikissa CC4821-kantojen analysoiduissa gyrA-sekvensseissä. Viisi paikkaa (91, 417, 665, 210 ja 288) poikkesivat toisistaan erittäin paljon, 40 % tai enemmän 129 sekvenssistä oli mutatoitunut näissä paikoissa. Esimerkiksi 48 prosentissa 129 sekvenssistä oli mutatoitunut jäännös paikassa 417 (kuva 2). Yksi asema (91) näytti liittyvän CIP-resistenssiin, sillä kaikki kannat, jotka eivät olleet herkkiä CIP:lle, olivat mutatoituneita tässä asemassa, ja niissä oli joko I-, F- tai V-merkki (lisätaulukko 2).

Potentiaalisten CIP-resistenssimarkkereiden tunnistaminen

226:sta analysoidusta sekvenssistä 174 oli peräisin kannoista, jotka oli testattu resistenssin varalta CIP:lle (lisätaulukko 1). Tässä tutkimuksessa testattiin 67 kantaa. Kuten edellä mainittiin, kaikki kannat, jotka eivät olleet herkkiä CIP:lle (ja joilla oli joko resistentti fenotyyppi (R puussa) tai intermediäärinen fenotyyppi (I puussa)), olivat mutatoituneet paikassa 91. Tämä osoitti, että kannan 91 mutaatio liittyi resistenssimekanismiin. Tässä tutkimuksessa testatuista 67 kannasta 49:ssä oli mutaatio kohdassa 91, mutta 23:lla näistä kannoista oli intermediäärinen resistenssifenotyyppi. Tämä viittasi siihen, että resistenssimekanismiin voi liittyä muitakin kohtia. Muiden mahdollisten resistenssimarkkereiden tunnistamiseksi 226 kantaa analysoitiin edelleen kunkin mutatoituneen kannan osalta. Muutos, jota esiintyisi resistenteissä kannoissa (mukaan luettuna intermediäärinen resistenssifenotyyppi), mutta jota ei esiintyisi herkissä kannoissa, olisi kelvollinen. Analyysin tiukkuuden lisäämiseksi mutaatiota, joka havaittiin vain yhdessä kannassa, ei kuitenkaan otettu huomioon. Kaikkiaan tunnistettiin 33 kohdetta (lisätaulukko 3; lisätaulukon 4 vasen puoli). Esimerkiksi H8N-mutaatio löytyi 18 resistentistä kannasta (joista kahdella oli välivaiheen fenotyyppi), mutta se ei esiintynyt yhdessäkään herkässä kannassa. Kaikki 226 kantaa analysoitiin näiden 33 paikan osalta. Jälleen kerran analyysin tiukuuden lisäämiseksi mutaatio, joka löytyi vähintään yhdestä herkästä kannasta, hylättiin. Näin ollen resistenteissä ja herkissä kannoissa havaittua mutaatiota D95N ei otettu huomioon. Kaikkiaan analysoitiin 39 mutaatiota (jotkut samassa kohdassa, kuten kohdassa 91) (vihreällä värillä lisätaulukon 4 vasemmalla puolella). Mutaatioprofiili muodostettiin 128 kannasta, joissa oli vähintään yksi kiinnostava mutaatio (lisätaulukko 3). Tunnistettiin 46 erilaista profiilia, mikä tarkoittaa, että kaikista analysoiduista kannoista löytyi 46 näiden 39 mutaation yhdistelmää (lisätaulukon 4 oikea puoli). 46:sta mutaatioprofiilista 16 koski CC4821-kantoja (punaisella merkityt numerot lisätaulukossa 4). Kaksikymmentäkuusi profiilia koski kantoja, joiden tiedettiin olevan CIP-resistenttejä (kantojen nimet sinisellä fontilla lisätaulukossa 4). Mutaatiot N103D ja T91I olivat 39:stä potentiaalisesta resistentistä merkkiaineesta yleisimpiä profiileissa, joissa esiintyi 29 ja 27 mutaatiota. On kuitenkin syytä huomata, että myös muut mutaatiot olivat hyvin edustettuina, kuten H8N, I111V, E793Q ja A679S, joita esiintyi 23, 21, 18 ja 17. On myös syytä huomata, että 45 prosentissa resistenteistä kannoista (58 kannassa 128:sta) esiintyi ainoastaan mutaatio T91I. Koska resistenssimarkkerit oli alun perin kuvattu E.coli-kannassa, oli tarpeen verrata E.colin ja N.meningitidis 53,442 -referenssikannan gyrA-sekvenssejä, jotta voitiin tarkistaa näiden markkereiden sijainti E.colin sekvenssissä (lisätaulukko 5).

Rekombinaatio gyrA-geenin sisällä N. spp:n välillä

Fylogeneettisessä analyysissä tunnistettiin potentiaalisia rekombinanttia. Esimerkiksi ryhmä 1 oli erityisen kiinnostava koskien N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 ja N.subflava-CP031251.1-M18660. Näillä kahdella sekvenssillä oli 7 yhteistä jäännösmuutosta, joita ei havaittu muissa kannoissa. Lisäksi 5 näistä muutoksista tapahtui 30 aminohapon sisällä (taulukko 1). Toisessa kannassa havaittuja aminohappomuutoksia ei havaittu toisessa kannassa, kuten asemissa 740 ja 750. Kaikki nämä havainnot viittasivat näiden kahden kannan väliseen rekombinaatioon, mikä vahvistettiin BootScan-analyysillä (kuva 3a). BootScan vahvisti kolme muuta mahdollista rekombinaatiota. Kuvassa 3b kuvattiin CC4821-kannan (todennäköisesti joko N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 tai N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) ja N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —– välinen rekombinaatio. Kuvassa 3c oli useita rekombinaatiotapahtumia N.lactamica-CP031253.1-M17106—– ja kahden N.meningitidis-kannan, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– ja N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R välillä. Lopuksi kuvassa 3d esitetään N.meningitidis-kantojen välinen rekombinaatio. Kaiken kaikkiaan rekombinaatioanalyysi osoitti, että Neisseria-kantojen gyrA-geeni on erittäin altis rekombinaatiolle.

Potentiaaliset rekombinaatiotapahtumat lajien välillä ja lajinsisäiset rekombinaatiotapahtumat Neisseria-kantojen välillä. a. Rekombinaatio N.subflavan ja N.meningitidiksen välillä. BootScan-diagrammi luotiin SimPlot-ohjelmassa käyttäen kyselynä N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005. b. N.cinerean ja N.meningitidiksen välinen rekombinaatio. BootScan-diagrammi luotiin SimPlot-ohjelmalla ja kyselynä oli N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. c. N.lactamican ja N.meningitidiksen välinen rekombinaatio. BootScan-diagrammi luotiin SimPlot-ohjelmalla ja kyselynä oli N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009. d. N.meningitidis-kantojen välinen rekombinaatio. BootScan-diagrammi luotiin SimPlot-ohjelmassa käyttäen kyselynä N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011. Kanta, jonka ennustetaan osallistuvan eniten rekombinaatioprosessiin (selkäranka), on esitetty punaisena viivana. N.meningitidis-referenssikanta 053442 (GB ID CP000381) on esitetty mustalla viivalla. Edellä on esitetty referenssikannan 053442 toiminnallinen kartta, joka perustuu kuvassa 2 esitettyyn E.coli-kannan toiminnalliseen karttaan

.