Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD)

2.1 Proteiinien laskostumisprosessi ja väärin laskostuneiden proteiinien tunnistaminen

Noin 30 % kaikista proteiineista ja kaikista solun transmembraaniproteiineista syntetisoidaan ER:ssä, joka toimii porttina, josta ne pääsevät Sec61-kanavan kautta erittävään reittiin . Translokaation yhteydessä peptidaasikompleksi pilkkoo juuri syntetisoidun proteiinin N-terminaalisen hydrofobisen signaalisekvenssin . Ko- ja posttranslationaaliset modifikaatiot, kuten disulfidisidosten muodostuminen, N-glykosylaation alkuvaiheet ja glykofosfatidyylinositolin (GPI) ankkurointi tapahtuvat ER:ssä.

Er:n hapettava ympäristö edistää disulfidisidosten muodostumista, mikä vakauttaa proteiinien tertiäärirakennetta ja helpottaa proteiinien kokoamista. Taittumisprosessin aikana disulfidisidoksia muodostuu proteiinidisulfidi-isomeraasien (PDI) hapettamalla kysteiinijäämien vapaiden tiolien pareja. PDI:t toimivat sykleinä, ja alkuperäisen hapettumisen jälkeen PDI:t ja ERp57, joka on tiolioksidoreduktaasi, isomerisoivat joskus disulfidisidoksia proteiinin oikean taittumisen vakauttamiseksi. Sitä vastoin väärin taitettujen proteiinien disulfidisidosten pelkistyminen on välttämätöntä ERADin retrotranslokaatiovaiheessa. PDI mahdollistaa simian virüs-40:n (SV-40) ja koleratoksiinin retrotranslokaation . ERdj5, ER-oksidoreduktaasi, vähentää disulfidisidoksia ja on vuorovaikutuksessa EDEM:n (ER-degradaatiota tehostava mannosidaasin kaltainen proteiini) kanssa ja nopeuttaa myös SV-40:n retrotranslokaatiovaihetta . ERDJ5 säätelee myös tautia aiheuttavan α1-antitrypsiinivariantin (null Hong Kong) hajoamista .

Foldausta avustavat molekyyliset chaperonit, jotka paimentavat vääränlaista foldausta ja unfoldausta vastaan. Chaperonin kaltaiset glykaanit sitoutuvat N-glykaaneihin, joilla on ratkaiseva rooli proteiinien taittumisessa ja hajoamisessa. On ilmeistä, että N-glykosylaatio, proteiinien taittumisen laadunvalvonta ja ERAD liittyvät toiminnallisesti toisiinsa. Kun suuri osa vastasyntetisoidusta polypeptidiketjusta on päässyt ER:ään, se glykosyloituu N-sidoksissa. Oligosakkaryylitransferaasientsyymi tunnistaa Asn-X-Ser/Thr-konsensussekvenssin suurimmassa osassa syntyvää proteiinimolekyyliä ja integroi proteiiniin kovalenttisesti runsaasti mannoosia sisältäviä ydinglykaaniryhmiä (Glc3Man9GlcNAc2), jotka ovat peräisin ER:n membraaniin lokalisoituneesta dikololista. Koska proteiiniin sitoutuneen oligosakkaridin triglykosyloituneen muodon puoliintumisaika on hyvin lyhyt, glykaanien prosessointi alkaa välittömästi sen jälkeen, kun esiasteiden glykaaniryhmät on siirretty glukosidaasientsyymien avulla. Kun kaksi kolmesta glukoosijäännöksestä on pilkkoutunut, syntyvä proteiini voi olla vuorovaikutuksessa laadunvalvontalektiinien, kuten CNX:n ja CLR:n, kanssa. Tämä vuorovaikutus säilyy jäljellä olevan glukoosijäännöksen pilkkomiseen asti. Kun glykoproteiini on vapautettu CNX/CLR-syklistä, myös viimeinen glukoosi leikataan, jolloin syntyy glykosyloimaton substraatti. Tämä vaarantaa substraatin vuorovaikutuksen lektiinikaperonien kanssa. Jos proteiini on tässä vaiheessa oikein taitettu, se voi poistua ER:stä lopulliseen määränpäähänsä. Jos glykoproteiini on kuitenkin vielä taittumaton, se pysyy ER:ssä ja reglukosyloituu UDP-glukoosi:glykoproteiiniglukosyylitransferaasin toimesta ja palautuu CNX:n ja CLR:n kanssa, jolloin proteiinille jää enemmän aikaa kunnolliseen taittumiseen. Reglykosylaatio/deglykosylaatiosyklien päättymiseen liittyviä mekanismeja ei vielä tunneta. On kuitenkin selvää, että jos polypeptidiketju ei pääse kypsään muotoonsa toistuvien taittumisyritysten jälkeen, ER α1,2-mannosidaasi I (ERMan1) poistaa vähitellen ydinglykaaniketjun terminaaliset mannoosijäännökset. ERMan1 tuottaa Man8GlcNAc2-isomeerin poistamalla mannoosijäännöksen N-glykaanien keskimmäisestä haarasta. Tällä trimmauksella glykoproteiinista tulee huonompia substraatteja reglykosylaatiolle ja CNX-kierrosta poistumiselle.

Kunnolla taitettujen proteiinien hydrofobiset laikut ovat yleensä haudattuina liukoisten proteiinien sisälle. Nämä laikut voivat kuitenkin paljastua väärin taitetuissa proteiineissa. Jos proteiinissa on paljastuneita hydrofobisia pintoja, BiP sitoutuu siihen piilottaakseen nämä aggregaatiolle alttiit pinnat asianmukaisia laskostumisyrityksiä varten estämällä aggregaation. Jos taittuminen ei kuitenkaan onnistu tai viivästyy, laajennettu chaperonin ja väärin taittuneen proteiinin vuorovaikutus palvelee hienostunutta prosessia, jossa proteiini siirretään toisille chaperoneille ja/tai ERAD-prosessiin.

On yleisesti hyväksytty, että ERAD-prosessin ensimmäinen vaihe on väärin taittuneiden proteiinien valikoituminen chaperoneilla. Jo vuonna 1999 havaittiin, että hiivan ERAD-substraatit erosivat toisistaan silmiinpistävän paljon sen suhteen, että ne vaativat ER-luminaalista Hsp70:tä, BiP:tä . Liukoisten substraattien, kuten pαF:n ja vakuolaproteaasin karboksypeptidaasi Y*:n (CPY*) mutanttimuodon, hajoaminen oli riippuvainen BiP:stä, kun taas transmembraaniproteiinien Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p ja Hmg2p hajoaminen tapahtui BiP:stä riippumattomalla tavalla. Vuonna 2004 osoitettiin, että substraatit, joilla oli sytosolinen domeeni, kuten Ste6-166p, hajosivat BiP:stä riippumattomasti, kun taas proteiinit, joilla oli luminaalisia vikoja, tarvitsivat BiP:tä, mikä viittaa siihen, että vääristyneen vaurion topologiasta riippuen (ER-luumen, ER-kalvo ja sytoplasma) sytosoliset tai luminaaliset chaperonit toimivat tunnistuksessa ja kohdentamisessa hajotusta varten.

Väärinfoldoituneiden proteiinien malliproteiineja käyttäen on mahdollista tutkia substraatin tunnistusta ERAD:in aikana. On selvää, että mannosylaation poistoa tarvitaan väärinfoldoituneiden glykoproteiinien hajoamiseen, koska tämän mannoosin trimmauksen estäminen stabiloi väärinfoldoituneita glykoproteiineja ER:ssä . ERMan1:n yliekspressio kiihdyttää N-glykosyloitujen proteiinien hajoamista . Tämän trimmauksen jälkeen syntyvästä Man8-GlcNAc2-pitoisesta glykoproteiinista tulee substraatti EDEM1:lle (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p hiivassa), joka on ER:ssä oleva mannosidaasiin liittyvä lektiini. Lisäksi ehdotettiin, että vääristyneet glykoproteiinit ovat vuorovaikutuksessa ERManI:n ja EDEM1:n kanssa niiden ERAD:ia varten, ja lektiinin ja hiilihydraatin vuorovaikutuksen todettiin olevan ratkaisevan tärkeää EDEM:n substraatin tunnistamisessa. Vaikka ERMan1:n ehdotettiin olevan biologinen ajastin, joka käynnistää vääristyneiden proteiinien ERAD:n, viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että mannosidaasit eivät ole yksin vastuussa intensiivisestä demannosylaatiosta ERAD:n aikana, varsinkaan ei-perusolosuhteissa. ER-stressiolosuhteissa (unfolded protein response active) EDEM1:n transkriptionaalinen kohoaminen lisää ERAD-tehokkuutta tukahduttamalla ERMan1:n proteolyyttisen downregulaation . Näytti siltä, että EDEM:llä on myös tärkeä rooli substraattien demannosylaatiossa . EDEM1 estää myös reglykosylaatiota ja edistää joidenkin ERAD-substraattien retrotranslokaatiota ja hajoamista . Toisaalta, vaikka Htm1p:n mannosidaasihomologiadomeeni (MHD) on välttämätön substraatin sitoutumiselle, nisäkkäiden EDEM1 sitoo MHD-domeenista riippumattomia väärinfoldoituneita proteiineja, ja siksi EDEM1:n substraatin sitoutuminen ei välttämättä edellytä mannoosin trimmausta tai edes glykosylaatiota . Näin ollen glykoproteiinien N-sidoksissa olevien oligosakkaridiryhmien lisäksi EDEM1 voi tunnistaa väärinfoldattujen proteiinien taittumisvaurioita. Yhteenvetona voidaan todeta, että EDEM:t osallistuvat suoraan tai epäsuorasti glykoproteiinien demannosylaatioon ja/tai toimivat reseptoreina, jotka sitovat ja kohdentavat mannoositrimmattuja proteiineja ERAD:iin (kuva 1).

Terminaalisen mannoosin typistäminen C-haarasta paljastaa α-terminaaliset α1,6-sidoksiset mannoosijäämät, jotka toimivat tunnistussignaalina ERAD-lektiineille, kuten OS9:lle (hiivassa Yos9) ja XTP3-B:lle (kuva 2). Molemmat proteiinit tunnistavat mannoosi-6-fosfaattireseptorihomologian (MRH) domeeninsa kautta ensisijaisesti α1,6-sidoksissa olevan mannoosin j. Lisäksi OS-9 tunnistaa myös α1,6-sidoksissa olevan mannoosin e ja c .

Monissa raporteissa on esitetty, että substraatin tunnistamiseen ja kohdentamiseen tarvittavat tekijät (EDEMit, OS9 ja XTP3-B) sijaitsevat supramolekyylikomplekseissa ja/tai ovat vuorovaikutuksessa tärkeiden ERADin säätelijöiden kanssa . Esimerkiksi EDEM1 on vuorovaikutuksessa CNX:n kanssa, vastaanottaa substraatteja CNX-kierrosta ja helpottaa ERAD-substraatin hajoamista, kuten NHK-α1-antitrypsiinimutaation . EDEM1 assosioituu myös ER-retrotranslokaatiokoneiston komponenttien kanssa. On ehdotettu, että EDEM1 sitoo väärinfoldattuja proteiineja ja käyttää MHD-domeeniaan kohdistaakseen poikkeavat proteiinit Hrd1-SEL1L-ubikitiiniligaasikompleksin ER-residenssissä olevalle glykoproteiinille SEL1L-proteiinille . SEL1L telineellistää useita luminaalisia substraatin tunnistustekijöitä ja yhdistää ne Hrd1:een. OS9 ja XTP3-B assosioituvat myös Hrd1-SEL1L-kompleksiin, johon kuuluvat myös BiP ja GRP94 . Lisäksi XTP3-B:n ehdotetaan yhdistävän BiP:n Hrd1-kompleksiin . Erään hypoteesin mukaan nämä kolme chaperonia (EDEM1, OS9 ja XTP3-B) toimivat oligomeereinä, joista yksi monomeeri on vuorovaikutuksessa substraatin kanssa ja toinen Hrd1-SEL1L-kompleksin kanssa . Lisäksi EDEM1 on vuorovaikutuksessa myös Derlinin kanssa, joka on transmembraaniproteiini, joka on ehdokas translokoniksi ; lisäksi Derlin2:n on osoitettu lisäävän EDEM1:n vuorovaikutusta sytosolisen AAA-ATPaasi p97:n kanssa, joka kytkee ATP:n hydrolyysin vääristyneiden proteiinien retrotranslokaatioon.

On selvää, että ERAD:n substraatin tunnistamisvaihe on monimutkainen mekanismi, jossa ERAD:iin osallistuu useita eri entsyymejä ja chaperoneja, joilla on ERAD:ssä erilaiset, mutta yhteiset tehtävät. Lisäksi osallistuvien proteiinien määrä ja ominaisuudet vaihtelevat substraattien mukaan. Esimerkiksi EDEM:n, ERdj5:n ja BiP:n on ehdotettu toimivan yhdessä vääristyneiden proteiinien hajottamisessa. Kun EDEM1 on poistunut CNX-CLR-syklistä, se leikkaa edelleen Man8-GlcNAc2-glykaanirakennetta ja ERdj5 vähentää disulfaattisidoksia. Samalla ERdj5 aktivoi BiP:n ATPaasiaktiivisuutta. ADP:hen sitoutunut BiP sitoutuu vääristyneeseen proteiiniin ja pitää sen retrotranslokaatiokomponentin muodossa, kunnes se siirtyy retrotranslokaatiokompleksiin .

ERAD osallistuu myös ei-glykosyloitujen proteiinien laadunvalvontaan, joka on riippumaton lektiinin kaltaisista proteiineista. Immunoglobuliinin kevytketju (Ig-K-LC), joka on glykosyloimaton ERAD-substraatti, hajoaa BiP:stä riippuvaisella tavalla. Okuda-Shimizu ja Hendershot ovat luonnehtineet ERAD-reittiä tälle ei-glykosyloituneelle BiP:n substraatille ja erilaisilla proteiinien vuorovaikutusdynamiikoilla nähdään olevan merkitystä tässä prosessissa. Ig-K-LC:ssä on kaksi intramolekulaarista disulfidisidosta, eikä sen täysin hapettunut muoto pysty siirtymään ER:stä sytoplasmaan. BiP on vuorovaikutuksessa Ig:n vain osittain hapettuneen muodon kanssa, mikä estää Ig-K-LC:n täydellisen hapettumisen ja helpottaa siten sen vapautumista ER:stä. Lisäksi transmembraanisen UBL-domeenin sisältävän proteiinin, homoCys-responsiivisen ER-residenssiproteiinin (HERP), on todettu olevan ei-glykosyloitujen BiP:n substraattien reseptori. HERP on vuorovaikutuksessa Derlin1:n kanssa, ja osittain hapettunut Ig-K-LC siirretään BiP:stä HERP-Derlin1-Hrd1-kompleksiin ja ohjataan sen jälkeen proteasomaaliseen hajoamiseen . BiP:n lisäksi myös ERdj5:n, joka toimii disulfidireduktaasina, on osoitettu olevan tärkeä ei-glykosyloitujen proteiinien ERAD:n kannalta . BiP:n sieppaamat glykosyloimattomat substraatit siirretään ERdj5:lle disulfidisidosten pilkkomista varten. Sitten nämä substraatit siirretään BiP:n avulla SEL1L:lle retrotranslokaatiota varten. BiP:n lisäksi sekä OS9:n että XTP3-B:n on todettu osallistuvan muiden kuin glykosyloitujen proteiinien ERAD:iin.