ELISpot Assay Principle

ELISpot-määrityksissä käytetään sandwich-entsyymi-immunosorbenttimääritystekniikkaa (ELISA). Joko monoklonaalinen tai polyklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen valitulle analyytille, on esipinnoitettu PVDF (polyvinylideenidifluoridi)-taustaiselle mikrolevylle. Sopivasti stimuloidut solut pipetoidaan kuoppiin ja mikrolevy asetetaan kostutettuun 37 °C:n CO2-inkubaattoriin tietyksi ajaksi. Tämän inkubaatioajan aikana immobilisoitu vasta-aine sitoo erittävien solujen välittömässä läheisyydessä erittyvää analyyttiä. Kun solut ja sitoutumattomat aineet on pesty pois, kuoppiin lisätään valitulle analyytille spesifinen biotinyloitu polyklonaalinen vasta-aine. Kun kaikki sitoutumattomat biotinyloidut vasta-aineet on pesty, lisätään streptavidiiniin konjugoitu alkalifosfataasi. Sitoutumaton entsyymi poistetaan tämän jälkeen pesemällä ja lisätään substraattiliuos (BCIP/NBT). Sinimusta sakka muodostuu ja näkyy täplinä sytokiinien lokalisoitumiskohdissa, ja jokainen yksittäinen täplä edustaa yksittäistä analyyttiä erittävää solua. Läiskät voidaan laskea automaattisella ELISpot-lukujärjestelmällä tai manuaalisesti stereomikroskoopin avulla.