Elektroporaatio ja kilpailevat transfektiomenetelmät

Angelo DePalma Ph.D. Kirjoittaja GEN

Elektroporaatio on ainutlaatuisen edullinen, koska se on monipuolinen – se toimii millä tahansa solulla, millä tahansa organismilla.

Elektroporaatiossa soluihin siirretään uusia lajeja, tavallisesti polaaristen polaaristen molekyylien kaltaisia lajeja. Tekniikka hyödyntää fosfolipidikaksoiskerrosten välisiä heikkoja vuorovaikutuksia, jotka ylläpitävät solukalvojen eheyttä. Tyypillisessä solukalvossa fosfolipidit on järjestetty siten, että niiden polaariset pääryhmät osoittavat ulospäin ja hydrofobiset pyrstöryhmät sisäänpäin, mikä estää polaaristen molekyylien kulun. Ilman jonkinlaista apua polaariset molekyylit eivät pääse sisään.

Kun soluihin kohdistuu hallittu sähköimpulssi, fosfolipidikerros aukeaa, jolloin syntyy tilapäisiä fyysisiä kanavia, joiden kautta molekyylit pääsevät sisään. Oikeissa olosuhteissa kanavat sulkeutuvat nopeasti, jolloin solu palaa alkuperäiseen tilaansa – paitsi että solu sisältää nyt vieraita molekyylejä.

Geenien suoran siirtämisen lisäksi elektroporaatio helpottaa plasmidien suoraa siirtoa solujen tai lajien välillä – esimerkiksi bakteereista hiivaan.

Laaja-alaisia kokeiluja tehdään edelleen elektroporaation käyttämiseksi lääkkeiden ja rokotteiden toimittamiseen suoraan elävien organismien soluihin. Tässä artikkelissa keskitytään ei-lääketieteellisiin sovelluksiin.

Elektroporaatiota käytetään yleisimmin solujen transfektointiin ohimenevästi, vaikka myös stabiili transfektio on mahdollista. Biolääketeollisuudessa transientti transfektio mahdollistaa jopa muutaman gramman proteiinin tuottamisen karakterisointia ja prekliinisiä tutkimuksia varten. Tässä sovelluksessa plasmideja hyödyntävä elektroporaatio on osoittautunut luotettavaksi ja ennustettavaksi. Elektroporaatio tuottaa samalla tavoin stabiilisti transfektoituja soluja edellyttäen, että DNA tuodaan linearisoidussa muodossa käsittelemällä se ensin restriktioentsyymillä.

Yksi tekniikka monien joukossa

Elektroporaatio on vakiinnuttanut paikkansa transfektiotekniikoiden kirjossa, johon kuuluvat muun muassa virusvektorit, kemialliset tai reagensseihin pohjautuvat metodit ja mekaaninen geenin siirto. Virusvektorit ovat yleisin menetelmä vakaasti transfektoitujen solujen tuottamiseksi terapeuttisten proteiinien valmistusta varten. Virusvektoreiden transfektiotehokkuus on erittäin korkea, mutta ne ovat rajoitettuja lisättävän DNA:n pituuden suhteen. Virusvektoreihin liittyy myös bioturvallisuuteen ja mutageenisyyteen liittyviä ongelmia.

Kokeellisesti käytetään myös muita mekaanisia tekniikoita, kuten mikrosaostusta, mikroinjektiota, liposomeja, hiukkaspommitusta, sonoporaatiota, laserindusoitua huokostusta ja bead-transfektiota. Näillä mekaanisilla tekniikoilla on yksi yhteinen tekijä. Ne häiritsevät solukalvoja ja mahdollistavat siten DNA:n pääsyn soluun. Joissakin menetelmissä – esimerkiksi ”geenipyssyssä” – geenit viedään suoraan kalvon läpi sytoplasmaan. Sieltä geenit voivat siirtyä tumaan.

Lisäksi on olemassa hybriditekniikoita, joissa hyödynnetään mekaanisten ja kemiallisten transfektiomenetelmien ominaisuuksia. Esimerkiksi viime vuosikymmenen aikana on ilmestynyt lukuisia artikkeleita magnetofektiosta, transfektiomenetelmästä, jossa yhdistyvät kemiallinen transfektio ja mekaaniset menetelmät. Esimerkiksi kationisia lipidejä voidaan käyttää yhdessä geenitykkien tai elektroporaattoreiden kanssa. Suurin osa magnetofektiokirjallisuudesta koskee geenien ja terapeuttisten molekyylien toimittamista eläviin organismeihin.

Elektroporaatiolla on useita etuja: monipuolisuus (toimii millä tahansa solutyypillä), tehokkuus, hyvin pieni DNA:n tarve ja kyky toimia elävissä organismeissa. Haittapuolina ovat mahdolliset soluvauriot ja molekyylien epäspesifinen kulkeutuminen soluun ja solusta ulos.

Kemiallisista, mekaanisista ja virusperäisistä transfektiomenetelmistä elektroporaatio yksinään tarjoaa kohtuullisen varmuuden onnistumisesta riippumatta kohdesolusta tai -organismista.

Elektroporaatio ja kemiallinen transformaatio ovat esimerkiksi kaksi johtavaa menetelmää, joilla DNA:ta voidaan syöttää Escherichia coliin. Jälkimmäisessä tapauksessa bakteerit on ensin tehtävä ”kyvykkäiksi” poistamalla puskurisuolat sen varmistamiseksi, että virta pääsee soluihin, minkä jälkeen sähköpulssi annetaan 0 °C:n lämpötilassa mikro-organismien vaurioitumisen vähentämiseksi. Kemiallinen transformaatio edellyttää suspensiota CaCl2:ssa, joka luo huokosia, ja sen jälkeen lämpöshokkia, joka pyyhkäisee DNA:n soluihin.

Toisessa lähestymistavassa käytetään kationisia lipidejä solukalvojen avaamiseen. Elektroporaatio on vähemmän hankalaa ja tehokkaampaa, toimii useammilla erilaisilla solutyypeillä ja soveltuu helpommin standardimenetelmiin kuin kemiallinen transfektio. Jotkut tutkijat suosivat kuitenkin mieluummin kemiallista transformaatiota, koska se ei vaadi laitteen hankkimista.

Innovaatioiden mahdollistaminen

Vaikka elektroporaatio kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna 1965, se avaa edelleen väyliä innovatiiviselle tieteelle instrumenttien, protokollien ja kokeilujen osalta. Ainakin kymmenkunta yliopistoryhmää on kehittänyt mikroelektromekaanisiin järjestelmiin (MEMS) perustuvia elektroporaatiolaitteita. Yksi mikrokanavapohjaisten laitteiden eduista on se, että ne voidaan suunnitella siten, että jännite ei ylitä sitä jännitettä, joka riittää kohtuullisen makromolekyylin sisällyttämisen aikaansaamiseksi. Tämä etu on myös haittapuoli. Toisin kuin kaupalliset elektroporaatiojärjestelmät, sirut eivät toimi kaikkien solujen kanssa.

Louisianan teknillisen yliopiston biolääketieteellisen tekniikan laitoksen ryhmä, jota johtaa tohtori Shengnian Wang, on havainnut, että kultaiset nanohiukkaset parantavat kaupallisten elektroporaatiolaitteiden suorituskykyä.1 Wang uskoo, että hyvin johtavat hiukkaset vähentävät soluväliaineen johtavuutta ja toimivat samalla ”virtuaalisina mikrosähkökoordinaattoreina”, jotka auttavat avaamaan fosfolipidikalvoja. Hän väittää, että suorituskyky paranee (DNA:n siirron tehokkuus paranee) ja solujen elinkelpoisuus paranee alhaisemman huokosjännitteen ansiosta.

Berliinin Charité Universitätsmedizinin2 tutkijat ovat kehittäneet yhdistetyn neliöpulssielektroporaatiostrategian solujen toistettavaan transfektioon. Filosofian tohtori Britta Siegmund ja työtoverit suspendoivat solut puskuriin ja altistavat ne aluksi korkeajännitepulssille, jota seuraa matalajännitepulssi, jonka sähköinen ja ajallinen arvo vaihtelee. Siegmund väittää, että elinkelpoisuus on verrattavissa tavanomaiseen elektroporaatioon ja että transfektiotehokkuus on jopa 95 prosenttia. Hän päättelee, että tekniikka voidaan ”helposti sovittaa vaikeasti transfektoitaviksi katsottuihin soluihin.”

Tavanmukaisen DNA-siirron lisäksi transfektiota on käytetty häiritsevän RNA:n tuomiseen eri solutyyppeihin. Tekniikka mahdollistaa annostelun ja siirron tehokkuuden kontrolloidun, pienimuotoisen tutkimuksen. Annosteluun ja annosteluun liittyvät ongelmat ovat vaivanneet käytännön RNA-interferenssisovelluksia terapiassa. Ainakin yhdessä tutkimuksessa on kuitenkin kyseenalaistettu, saadaanko RNA-interferenssigeenit tehokkaimmin sisällytettyä primäärisoluihin transfektioreagensseilla vai elektroporaatiolla.3

Kirsty Jensen, Ph.D., ja hänen kollegansa Edinburghin yliopistosta vertasivat 11 ohimenevän transfektioreagenssisarjan ja elektroporaation tehokkuutta immunomoduloivan Välimeren kuumeen geenin (MEFV:n) hiljentämisessä nautaeläinten monosyyttiperäisissä makrofageissa. Ryhmä testasi menetelmiä pienen häiritsevän RNA:n imeytymisen, kohdegeenin tyrmäyksen, solutoksisuuden ja tyypin I interferonivasteen indusoimisen osalta.

Elektroporaatio oli suunnilleen yhtä tehokas MEFV:n tyrmäyksessä kuin transfektioreagenssit. Toisin kuin reagenssit, elektroporaatio ei aiheuttanut interferonivastetta, mutta solujen elinkelpoisuus oli alhaisempi. Elektroporaation elinkelpoisuuteen ja transfektiotehokkuuteen liittyviä kysymyksiä pidetään yleensä tekniikan näennäisarviona.

Tohtori Jensen päätteli, että ”transfektioreagenssien käyttö soveltuu paremmin kuin elektroporaatio työhömme, jossa tutkitaan isäntämakrofagien geenien roolia infektiovasteessa”, mutta että ”valinta siitä, transfektoidaanko soluihin transfektoimalla vai elektroporaatiolla pientä häiritsevää RNA:ta, on riippuvainen yksittäisistä kokeista”.”

Ainakin joissakin tapauksissa, joissa elektroporaatiotulokset eivät ole optimaalisia, tutkijat ovat laiminlyöneet muiden olosuhteiden kuin sähköpulssin voimakkuuden optimoinnin. Kuten Hu ja työtoverit hiljattain totesivat,4 elektroporaation tehokkuuteen vaikuttavat muut kuin sähköiset tekijät, kuten solu- tai kudostyyppi ja DNA:n muotoilu.

Elektroporaatiosta on tullut välttämätön menetelmä sekä in vitro- että in vivo -kehitysbiologiassa. Suuri osa tästä työstä tapahtuu yksittäisissä soluissa, mikä edistää mallia, joka on erittäin kiinnostava terapiassa, diagnostiikassa, lääkkeiden toimittamisessa ja solubiologiassa. Yksittäisten solujen suora nanoporaaminen on hankalaa porauksen jälkeiseen elinkelpoisuuteen liittyvän epävarmuuden vuoksi.

Northwesternin yliopiston tutkijat ovat kehittäneet yhden solun tekniikan, jolla saavutetaan korkea elinkelpoisuus ja tehokkuus.5 Heidän lähestymistapansa käyttää mikrovalmisteista valmistettua cantilever-laitetta, nanolähdesondia (nanofountain probe, NFP). Se toimittaa molekyylit soluihin hellävaraisemmin kuin irtotavarana tapahtuva mikroinjektio tai nanoporaatio. Tutkijat ovat osoittaneet yksittäisten HeLa-solujen NFP-välitteisen elektroporaation, jonka transfektiotehokkuus on parempi kuin 95 %, elinkelpoisuus 92 % ja annoksen laadullinen hallinta.

NFP:t ovat parannus vanhempiin transfektiotekniikoihin, joissa käytetään atomivoimamikroskoopin antureita. Atomivoimamikroskopiaan perustuvat tekniikat aiheuttavat usein solujen kiinnittymisen menetyksen tai repeämisen. NFP aiheuttaa vähemmän vahinkoa soluille.