Early anthropoid femora reveal divergent adaptive trajectories in catarrhine hind-limb evolution

The new Aegyptopithecus femur

DPC 24466 (Fig. 1c) löydettiin vuonna 2009 Quarry M:stä, Jebel Qatranin muodostuman ylemmästä jaksosta (kuva 1b). Tämän kerroksen katsotaan olevan 29,5-30,2 Ma Seiffertin28 suosiman magnetostratigrafisen korrelaation perusteella, mutta se voi olla vieläkin nuorempi, jos Gingerich29 ja Underwood ym.30 ovat oikeassa sijoittaessaan koko Jebel Qatrani -muodostuman oligoseeniin. A. zeuxis on siis vähintään ~4,5-5,0 Ma vanhempi kuin vanhimmat tunnetut fossiiliset hominoidit ja cercopithecoidit, jotka on löydetty 25,2 Ma:n ikäiseltä paikalta Tansanian Nsungwen muodostumasta1. DPC 24466:n osoittaminen A. zeuxikselle perustuu siihen, että Louhos M:stä (tai läheisestä Louhos I:stä) ei ole tunnistettu muita samankokoisia kädellisiä taksoneita yli viiden vuosikymmenen intensiivisten kenttätutkimusten jälkeen31 , joiden aikana on tunnistettu tuhansia selkärankaisten fossiileja. Simons31 piti todennäköisenä, että George Olsenin vuonna 1907 keräämä (ja virheellisesti ”lihansyöjäksi” tunnistettu) ensimmäinen A. zeuxis -lajin yksilö löydettiin louhoksesta M tai hyvin läheltä sitä, mikä osoittaa, että louhos on mahdollisesti tunnettu 112 vuotta. Kuten useat muutkin Jebel Qatranin muodostuman ylemmän jakson kohteet, louhos M on karkearakeinen fluviaalinen kohde, joka on historiallisesti ”korjattu tuulella” pyyhkäisemällä serir (aavikon päällyste) pois joka vuosi, jolloin kiinteytymätön hiekka ja sora pääsee puhaltamaan pois ja paljastamaan alla oleviin sedimentteihin upotettuja fossiileja.

DPC 24466 on oikea reisiluu, joka on pääosin täydellinen lukuun ottamatta distaalista osaa, joka on katkennut pois varresta proksimaalisesti epikondyylien kohdalta. Näytteen säilynyt pituus on 112,1 mm, ja varren distaalisen mediolateraalisen laajenemisen perusteella (proksimaalisesti epikondyyleihin nähden) se näyttää olleen melko lyhyt. Hieman syöpyneen reisiluun pään superoinferiorinen halkaisija on 13,2 mm, ja sen fovea capitis on posteroinferiorinen nivelpinnan keskikohdasta. Reisiluun pään ylempi ja takimmainen osa on jatkuva reisiluun kaulan kanssa. Pään nivelpinta näyttää ulottuvan reisiluun kaulan päälle yläviistoon ja erityisesti takaosaan (vaikkakin rapautunut pinta estää selvän arvion sen täydestä ulottuvuudesta), mikä viittaa siihen, että lonkan asento on painottunut taivutettuun asentoon, jollaista käytetään nelijalkaisten hyppyjen ja juoksun aikana18,32,33. Reisiluun kaulan takaosassa oleva kyhmy, jota joskus kutsutaan paratrochanteric crestiksi34 ja joka on tyypillisesti havaittavissa varhais- ja keskimioenikauden hominoideilla ja joillakin elävillä ja sukupuuttoon kuolleilla antropoideilla34,35,36, puuttuu. Kaula on antevertoitu <15°, ja reisiluun kaulan ja varren välinen kulma on 125° (”yleistetyllä alueella”, eli suspensioapinoiden alapuolella, mikä vastaa aiempia arvioita; ks. lisätaulukko 4). Isompi trokanter sijaitsee suunnilleen samalla tasolla kuin pää tai hieman sen alapuolella. Pienempi trochanter on hyvin kehittynyt ja työntyy varresta posteromediaalisesti noin 40°:n kulmaan, mikä on hyvin antropoidien alueella34. Kuten aiemmin on todettu27 , Aegyptopithecuksen reisiluussa on selvä kolmas trokanter, joka on plesiomorfinen piirre, joka esiintyy kruunun strepsirrhineillä, adapiformisilla, omomyiformisilla, kantamantropoideilla, kantamatroriineilla, kantakatrriineilla ja joillakin mioseenihominoideilla34,36,37.

Suurin osa reisiluun varresta on hyvin säilynyt, ja se on suhteellisen suora kaikissa kuvissa. Reisiluu on hieman platymerinen lähellä arvioitua keskiakselia (Täydentävä kuva 2) ja muuttuu distaalisesti platymerisemmäksi. On mahdollista, että jonkinasteinen kuolemanjälkeinen muodonmuutos vaikuttaa distaalisen pään äärimmäiseen platymeriseen ulkonäköön. Varren posteriorisessa proksimaalisessa osassa on säilynyt köli, joka todennäköisesti vastaa lähentäjälihaksen kiinnittymiskohtaa38. Distaalisesti keskiakselin kohdalla köli haarautuu harjanteiksi, jotka kulkevat distaalisen varren mediaaliselle ja lateraaliselle puolelle. DPC 24466:n täydellinen kuvaus on saatavilla Supplementary Note 1:ssä.

Aegyptopithecus-yksilön, johon DPC 24466:n reisiluu kuului, ruumiinpainoa arvioitiin eri regressioilla (hominoidinäyte, cercopithecoidinäyte, yhdistetty näyte) reisiluun pään superoinferiorisen läpimitan ja reisiluun varren anteroposteriorisen läpimitan perusteella. Regressiot on kuvattu kohdassa Ruff39, ja kaikki estimaatit (mukaan lukien 95 prosentin luottamusvälit) on esitetty lisätaulukossa 5. Kolmen eri regression avulla reisiluun pään perusteella saadut vaihteluvälit (3,1-5 kg) olivat pienemmät kuin reisiluun varren perusteella saadut vaihteluvälit (6,8-8,5 kg). Näiden kahden välineen avulla saadut painoarviot edustavat luultavasti ääriarvioita, koska alempi arvio on saatu hieman hiertyneestä reisiluun pään pinnasta ja suurempi arvio on saatu hyvin platymerisestä varresta (erityisesti distaalisesti). Kun otetaan huomioon edellä esitetyt todisteet, näiden kahden ääripään välissä olevaa arviota pidetään järkevimpänä. Jos näin olisi, tämän yksilön arvioitu ruumiinpainon vaihteluväli on yhdenmukainen useimpien tämän taksonin osalta julkaistujen arvioiden kanssa, joiden mukaan Aegyptopithecus painaa 6-7 kg27,40,41.

Femoraalin muodon vaihtelu antropoideilla

Elävän ja fossiilisen näytteen 3D-muoto-affiniteettien arvioinnissa käytettiin apuna 14:ää 3D-maamerkkiä (3D surface landmark), jotka kuvastavat luun ko. osan yleismuotoilua (Täydentävä kuvio 1, Täydentävä taulukko 1). Nämä maamerkit kerättiin myös laajasta näytteestä eläviä ja fossiilisia antropoideja (lisätaulukot 2 ja 3). Antropoidien reisiluun muodon vaihtelua kuvaava morfosfääri muodostettiin käyttämällä nykyisten lajien keskiarvojen ja fossiilisten yksilöiden Procrustes-koordinaattien pääkomponenttianalyysin (PCA) kahta ensimmäistä akselia, ja yksittäiset nykyiset yksilöt piirrettiin morfosfääriin jälkikäteen (Kuva 2, Täydentävä kuva 3; ks. kohta ”Geometrinen morfometria” jaksossa ”Menetelmät”). Tämä lähestymistapa (”between-group PCA” tai bgPCA) maksimoi a priori tunnistettujen ryhmien välisen variaation ja ottaa samalla huomioon lajinsisäisen variaation42. Kun kahta ensimmäistä komponenttia tarkastellaan yhdessä, platyrrhiinit (tai Uuden maailman apinat (NWM)), cercopithecoidit ja hominoidit erotetaan toisistaan. Hominoidien-serkopithekoidien (bgPC1) ja platyrrhiinien-catarrhiinien (bgPC2) reisiluun muodonmuutokset on esitetty visuaalisesti täydentävässä kuvassa 4 (ks. tarkemmat tiedot jäljempänä kohdassa ”Evoluutiomallinnus”). Aegyptopithecus (DPC 24466), varhaismioenin NWM Homunculus (MACN-A 5758) ja keskimioenin OWM Victoriapithecus (KNM-MB 35518) jäävät nykyisten taksonien vaihteluvälin ulkopuolelle, kun taas fossiiliset apinat Epipliopithecus ja fossiiliset hominiinit (eli ihmisklaadi) kuuluvat nykyisten hominoidien vaihteluvälin sisään. Rakennettiin samanlainen morphospace, jossa yksittäiset fossiilit eivät osallistuneet ominaisanalyysiin, vaan ne piirrettiin jälkikäteen (täydentävä kuva 5). Tämän lähestymistavan avulla pystyimme kontekstualisoimaan fossiilisten taksonien muodon sukulaisuutta vain elävien antropoidien määrittelemän morphospacen perusteella. Tämä analyysi tuotti vielä paremman erottelun elävien pääkladien välillä, kun taas fossiiliset yksilöt näyttävät olevan lähempänä toisiaan.

Muotoanalyysi antropoidien proksimaalisesta reisiluusta. Kuvaaja esittää ryhmien väliselle kovarianssimatriisille suoritetun analyysin (bgPCA) kaksi ensimmäistä pääkomponenttia. Ryhmät edustavat nykyisiä lajeja ja fossiilien keskipisteitä, ja yksittäiset yksilöt ja fossiilit on piirretty post hoc. DPC 24466:n TPS (Thin-plate-spline) -poimutetut versiot, jotka kuvaavat vaihtelun ääripäitä kullakin akselilla, on esitetty täydentävässä kuvassa 4. Värikoodit ovat seuraavat: Uuden maailman apinat, vaaleanruskea; vanhan maailman apinat, vihreä; ihmisapinat ja ihmiset, oranssi; hylobatidit, violetti; fossiiliset hominiinit, vaaleanpunainen; muut fossiiliset kädelliset, harmaa; Aegyptopithecus DPC 24466:n reisiluu on musta. Edustettujen fossiilien taksonomiset määritteet ovat seuraavat: DPC 24466, Aegyptopithecus zeuxis; MACN-A 5758, Homunculus patagonicus; KNM-MB 35518, Victoriapithecus macinnesi; NHMW1970/1397/0023, Epipliopithecus vindobonensis; MUZ-M80, Morotopithecus bishopi; KNM-MW 13142A, Ekembo nyanzae; BMNH-M 16331, Equatorius africanus; IPS41724, cf. Dryopithecus fontani; IPS18800, Hispanopithecus laietanus; AL333-3 ja AL288-1, Australopithecus afarensis; SK 82 ja SK 97, vrt. paranthropus robustus; KNM-ER 1481, vrt. homo erectus. Pongon ja Symphalanguksen siluetit tehtiin tilaustyönä. Papion siluetti ladattiin osoitteesta www.phylopic.org, ja se on lisensoitu vapaaseen käyttöön ilman tekijänoikeuksia. Cebus apellan siluetti ladattiin myös osoitteesta www.phylopic.org (kiitos Sarah Werningille, ja se on käytettävissä CC BY 3.0 -lisenssillä). Kirjoittajat muuttivat alkuperäisiä värejä. Lähdetiedot on annettu Source Data -tiedostona

Evoluution mallintaminen

Antropoidien reisiluun evoluution adaptiivisia malleja tutkittiin käyttämällä moniasteista Ornstein-Uhlenbeckin (OU) stabiloivaa valintamallia43. Tässä evoluutiomallissa tarkastellaan, miten eri kladeissa tapahtuu siirtymiä kohti erilaisia fenotyyppejä (”optimaalisia fenotyyppisiä arvoja” tai ”sopeutumishuippuja”) tunnistamalla eri evoluutio-”järjestelmät” (ks. lisätietoja kohdasta ”Evoluutiomallinnus” kohdassa ”Menetelmät”). Tätä pintamenetelmää44 sovellettiin ensin ”naiivisti” mahdollisten järjestelmien siirtymien tunnistamiseen sovittamalla sarja stabiloivia valintamalleja ja käyttämällä vaiheittaista algoritmia fenotyyppisten siirtymien paikantamiseksi fylogeneettiseen puuhun (eli ilman järjestelmien aiempaa tunnistamista).

Kohtaisesti aloittaen OU-mallista, jossa kaikki lajit vetävät puoleensa yhtä ainoaa adaptiivista optimia morfosfäärissä, ”pinnalla” käytetään vaiheittaista mallinvalintamenettelyä, joka perustuu hienojakoisiin näytteisiin perustuvaan Akaiken informaatiokriteeriin (AICc)45,46 yhä monimutkaisempien usean regiimin mallien sovittamiseksi. Jokaisella askeleella lisätään uusi regiimisiirtymä siihen fylogenian haaraan, joka parantaa eniten mallin sopivuutta kaikkien tarkasteltujen muuttujien osalta, ja siirtymiä lisätään, kunnes parannusta ei enää saavuteta. Todellisen konvergenssin todentamiseksi tässä menetelmässä arvioidaan sitten, paraneeko AICc-pistemäärä entisestään, jos eri lajien sallitaan siirtyä kohti yhteisiä sopeutumisjärjestelmiä sen sijaan, että kunkin lajin edellytettäisiin saavuttavan oman huippunsa. Yleisesti ottaen OU-mallinnus on hyödyllinen mahdollisten adaptiivisten järjestelmien ja järjestelmien siirtymien tunnistamisessa, vaikka se on tilastollisesti hyvin monimutkainen, ja siksi tuloksia on tulkittava varovasti47.

Kun tätä menetelmää sovellettiin proksimaalisen reisiluun muodon vaihtelun tärkeimpiin osatekijöihin – mukaan luettuna ekstantti- ja fossiililajit ominaissuuntaisessa analyysissä (Täydentävä kuvio 3) sekä keskipisteen koon (CS; luonnollista logaritmia käytettäessä) -, se havaitsi kymmenen erilaista evoluutio- eli evoluutio- eli kehittymisjärjestelmää, jotka vaikuttivat antropoideihin kuuluvan reisiluun evoluution aikana. Kukin järjestelmistä on merkitty eri väreillä fylogeneettisen puun reunoilla (kuva 3a) ja saman morfosfäärin kahdella representaatiolla (aliavaruudet), joissa näkyvät johdetut adaptiiviset optimaalit (kuvat 3b, c). Kunkin evoluutiojärjestelmän edustajat on esitetty kuvassa 3d, ja kuhunkin PC-akseliin kuvissa 3b, c liittyvät johdetut muodonmuutokset on esitetty täydentävässä kuvassa 4. Huomattakoon, että yksilötiedot (kuva 2) ja lajien keskiarvot/adaptiiviset optimiarvot (kuva 3b) esitetään samassa morfosfääriavaruudessa (niiden ominaisanalyysi on täsmälleen sama). Aegyptopithecus, Victoriapithecus ja Homunculus ovat yhdessä antropoidien plesiomorfisessa järjestelmässä (punainen), joka eroaa kaikista muista analysoiduista elävistä tai fossiilisista lajeista. Tutkimuksessa mukana olevien elävien platyrrhiinien oletetaan kehittyneen neljässä eri järjestelmässä, joista plesiomorfisinta edustavat Callicebus ja Aotus platyrrhiinipuun eri osissa. Pithecia-Chiropotes-, Ateline- ja Cebus-Saimiri-klaadit edustavat vastaavasti omia evoluutiojärjestelmiään. Katarriinien osalta kaikki cercopitheciinit ja Nasalis jakavat yhteisen järjestelmän, kun taas Colobus-Piliocolobus poikkeavat omalle järjestelmälleen. Molempien järjestelmien väliset erot liittyvät pieniin eroihin PC3:n varrella ja erityisesti reisiluun koossa (kuva 3c). Hominoidien sisällä on kolme erilaista järjestelmää: Kaikki fossiiliset apinat ja hylobatidit, elävät ihmisapinat (konvergentti regiimi) ja vastaavasti hominiinit.

Adaptiiviset regiimit ihmisapinoidien proksimaalisen reisiluun muodon kehityksessä. a Aikakalibroitu kronometrinen puu, joka kuvaa antropoidien proksimaalisen reisiluun muodon evoluution aikana tapahtuneiden adaptiivisten huipunsiirtymien arvioitua fylogeneettistä historiaa (kukin väri edustaa eri evoluutiojärjestelmää). b, c Morfosfäärit, joissa näkyvät arvioidut adaptiiviset optimit (suuret ympyrät) ja lajit (pienet ympyrät), jotka ovat kehittyneet kussakin a-kohdassa esitetyllä evoluutiojärjestelmällä. Konvergentti optimi on merkitty punaisella ääriviivalla. Kuhunkin akseliin liittyvät muodonmuutokset ovat samankaltaisia kuin kuvassa 2 esitetyt (joskin käänteisellä PC2:lla). Täydentävässä kuvassa 4 on esitetty katarriinien reisiluun erilaistumisen evoluutiohistoriaa kolmea ensimmäistä PC-akselia pitkin. d Kustakin evoluutiojärjestelmästä valittujen reisiluun muotojen morfologinen vertailu (skaalattu samanlaiseen mediolateraaliseen kokoon). Kohdassa a olevien kädellisten siluetit havainnollistavat kunkin järjestelmän valittuja kädellisiä. Ne on ladattu osoitteesta www.phylopic.org, ja ne on lisensoitu vapaaseen käyttöön ilman tekijänoikeuksia. Poikkeuksena ovat seuraavat siluetit: Cebus apella (luotto Sarah Werningille ja käytettävissä CC BY 3.0 -lisenssillä), Ekembo nyanze (luotto Nobu Tamuralle ja muokannut T. Michael Keesey, CC BY-SA 3.0 -lisenssillä), Aegyptopithecus zeuxis (luotto Mateus Zicalle ja muokannut T. Michael Keesey, CC BY-SA 3.0 -lisenssillä). Pongon siluetti tehtiin tilaustyönä. Lähdetiedot toimitetaan Source Data -tiedostona

Alkaen Aegyptopithecuksen kaltaisesta morfologiasta hominoidit ja cercopithecoidit ovat kehittyneet vastakkaisiin suuntiin fenotyyppisen vaihtelun pääakselia pitkin (ts. PC1 kuvassa 3b): Ensin mainituilla on kehittynyt proksimaalisesti leveämmät reisiluut, joilla on pidemmät anatomiset kaulat ja suuremmat, proksimaalisemmin sijaitsevat päät (suhteessa isompaan trokanteriin), kun taas jälkimmäisten proksimaaliset reisiluut ovat muuttuneet kapeammiksi, ja niillä on lyhyemmät kaulat ja suhteellisesti pienemmät päät, jotka sijaitsevat suurentuneen kolmannen trokanterin alapuolella (täydentävä kuva 4). Pinta-analyysissä havaittiin yksi ainoa konvergentti järjestelmä elävien ihmisapinoiden puussa, mikä viittaa siihen, että ne siirtyivät itsenäisesti plesiomorfisesta hominoidien järjestelmästä kohti yhteistä konvergenttia optimia.

Tämän tuloksen tarkistamiseksi tehtiin kaksi herkkyysanalyysiä. Ensin testattiin ihmisapinoiden osalta havaittua homoplastisen evoluution mallia, ja analyysi toistettiin kolmella vaihtoehtoisella fylogeneettisellä puulla, joissa fylogeneettisesti kiistanalaiset eurooppalaiset fossiiliset ihmisapinat edustivat vastaavasti kantahominideja (”puu1”), kantapongiineja (”puu2”) ja afrikkalaisia kantamaisia ihmisapinoita (”puu3”). Kaikissa tapauksissa tulokset olivat identtiset (täydentävä kuva 6; ks. myös ”Fylogeneettisen puun rakentaminen” kohdassa ”Menetelmät” ja Nexus-puut, jotka ovat saatavilla tämän artikkelin lisätiedoissa 1-3). Toiseksi verrattiin tämän melko monimutkaisen evoluutiomallin (eli ”pinta”-tuloksen, jossa on 10 erilaista evoluutiojärjestelmää) tilastollista sopivuutta kahteen yksinkertaisempaan malliin: Molemmat osoittivat paljon vähemmän tukea (ΔAICc > 120; Täydentävä kuva 7).

Yksi OU-malleissa ja erityisesti ”surface”-mallilla estimoitavista evoluutioparametreista on ”fylogeneettinen puoliintumisaika” (t1/2), joka antaa arvion sopeutumisnopeudesta43. Se edustaa keskimääräistä aikaa, joka kuluu evoluution puoliväliin uuteen optimiin kehittymiseen, kun otetaan huomioon alkava evoluutiojärjestelmän muutos. t1/2-estimaatit kullekin muuttujalle olivat: t1/2 PC1 = 0,561, t1/2 PC2 = 1,041, t1/2 PC3 = 0,308, ja t1/2 lnCS = 2,339. Tämä tarkoittaa esimerkiksi sitä, että otoksen keskimääräiseltä antropoidilta kestää ~0,5 miljoonaa vuotta kehittyä puoliväliin kohti uutta optimia PC1:n varrella, ~1 miljoonaa vuotta PC2:n varrella, ~0,3 miljoonaa vuotta PC3:n varrella ja ~2,3 miljoonaa vuotta lnCS:n suhteen. Nämä tulokset voivat viitata muun muassa siihen, että reisiluun morfologiset sopeutumiset, jotka erottavat hominoidit ja cercopithecoidit toisistaan (joita PC1 kuvaa), tapahtuivat kaksi kertaa nopeammin kuin catarrhine-platyrrhine-erilaistuminen, jota PC2 kuvaa (ks. kuvat 2 ja 3 ja täydentävä kuva 4). Ihmisapinoiden ja ihmisten väliset muutokset (joita PC3 kuvaa) tapahtuivat viime aikoina ja jopa nopeammin, ja reisiluun koon muutokset (joita lnCS approksimoi) olivat hitaimpia.

Mahdollinen varoitus tämän lähestymistavan suhteen on se, että ”surface” olettaa, että syötemuuttujat ovat toisistaan riippumattomia, jotta voidaan laskea yhteenveto lopullisista AICc-pistemääristä parhaan kokonaismallin valitsemiseksi. Adams ja Collyer48 osoittivat, että ominaisuuksien ulottuvuuksien välisen riippumattomuuden olettaminen (kun ne eivät ole riippumattomia) voi johtaa mallin virheelliseen spesifiointiin tätä menetelmää käyttäen (ks. myös ref. 49,50). Tämän keskeisen mahdollisen ongelman ratkaisemiseksi, joka on todennäköisempi fylogeneettistä PCA:ta käytettäessä kuin tässä tapauksessa51 , testasimme, korreloivatko evoluutioanalyyseihin sisältyvien pääkomponenttien (PC:t 1-3) yksilöiden pistemäärät keskenään käyttämällä fylogeneettistä yleistettyä pienimmän neliösumman menetelmää. Tulokset osoittavat, että vaikka PC1-pisteet korreloivat PC2- ja PC3-pisteiden kanssa (mutta eivät PC2-pisteet PC3-pisteiden kanssa), suhde selittää vain hyvin pienen osan ennustettavissa olevasta kovariaatiosta (r2 PC1-2 = 0,009, r2 PC1-3 = 0,002). Tämän perusteella olemme vakuuttuneita siitä, että monimuuttujainen multi-OU-mallinnuksemme on vankka, erityisesti koska tämä menetelmä toimii paljon paremmin käyttämällä vähintään 2-4 muuttujaa44. Näiden tulosten täydentämiseksi kunkin alkuperäisen muuttujan yksilölliset mallien sovitukset raportoidaan myös ja niitä käsitellään täydentävässä kuvassa 8.

Koko ja fylogeneettiset allekirjoitukset

Kokonaisen reisiluun muodon ja koon välistä suhdetta tarkasteltiin kaikkien Procrustes-koordinaattien ja niiden CS:n fylogeneettisen monimuuttujaregression52 avulla. Tämä suhde ei osoittautunut tilastollisesti merkitseväksi (permutaatiotesti; 1000 kierrosta). Negatiivisia tuloksia saatiin myös tarkasteltaessa kolmea ensimmäistä vaihteluakselia erikseen. Näin ollen voidaan päätellä, että reisiluun muodon eroja tutkittujen taksonien välillä ei voida selittää pelkästään reisiluun koon eroilla.

Antropoidien proksimaalisen reisiluun fylogeneettistä signaalia tutkittiin sekä sen koon (sekä CS että logaritmimuunnettu CS käyttäen luonnollisia logaritmeja) että muodon (kolme ensimmäistä PC:tä ja kaikki Procrustes-koordinaatit) osalta käyttäen Blombergin K-tilaston53 yleistettyä versiota, joka on sovitettu kolmiulotteiseen dataan54. Tällä menetelmällä K:n arvot vaihtelevat välillä 0 → ∞, ja odotettu arvo on 1,0 Brownin liikkeessä. Arvot K < 1,0 kuvaavat tietoja, joiden fylogeneettinen signaali on odotettua pienempi, ja arvot K > 1,0 kuvaavat tietoja, joiden fylogeneettinen signaali on odotettua suurempi. Käyttämällä joko lnCS:ää tai CS:ää havaittu fylogeneettinen signaali on odotettua suurempi proksimaalisen reisiluun koon osalta (K = 2,410 ja K = 2,066, vastaavasti). Kun evoluutiomallinnuksessa tutkittuja kolmea ensimmäistä PC-akselia tarkastellaan kerralla, proksimaalisen reisiluun muodon vaihtelun havaitaan kehittyneen lähelle Brownin odotusta (K = 0,972), kun taas sen kokonaismuodossa (eli kaikissa Procrustesin koordinaateissa tai kaikissa PC:ssä; K = 0,506) se on odotettua pienempi. Lopuksi, kun tutkitaan kerralla samoja muuttujia, joita käytettiin ”pinta-analyysissä” (eli kolmea ensimmäistä PC-akselia ja lnCS:ää), K = 2,245. Kaikissa tapauksissa K-arvot olivat merkitseviä (P ≤ 0,001). K arvioitiin tilastollisesti permutaatiolla (1000 kierrosta), jossa fylogenian kärjissä olevat tiedot satunnaistettiin suhteessa puuhun, ja jokaisella kierroksella saatiin satunnaiset K-arvot, joita sitten verrattiin todellisen puun avulla saatuihin K-arvoihin. Nämä erityiset tulokset saatiin käyttämällä puuta 1, mutta vastaavat tulokset saatiin myös puilla 2 ja 3 (ks. lisäkuva 6).