Defosforylaatio

V.B Proteiinifosfataasit RPTK-signaloinnissa

Tyrosiinin defosforylaatio on toinen nopea mekanismi, jolla RPTK:iden signaalinvälitys estetään tai lopetetaan. Proteiinien fosforylaatio signaalinsiirrossa on reversiibeliä, ja PTK:t toimivat yhdessä PTPaasien kanssa määrittäessään tyrosiinifosforylaation käynnistymistä, laajuutta ja päättymistä. RPTK-signaalin alenevaa säätelyä ei tapahdu ainoastaan itse RPTK:n suoran fosfotyrosiinin defosforylaation kautta (eli RPTK on PTPaasin substraatti), vaan myös RPTK:n tärkeän myöhemmän kohteen defosforylaation kautta. Koska tyrosiinifosforyloituneet proteiinit, seriini- ja treoniinifosforyloituneet proteiinit ja jopa fosfolipidit ovat RPTK-signalisaation välittäjiä, on olemassa esimerkkejä proteiinien seriini-/treoniinispesifisistä fosfataaseista ja fosfoinositidispesifisistä lipidifosfataaseista, jotka välittävät myös RPTK:n synnyttämän signalisaation alasäätämistä. Seuraavassa on joitakin esimerkkejä sekä lyhyt, yleinen kuvaus proteiinifosfataaseista.

Kaikki tunnistetut PTPaasit sisältävät konservoidun, ∼280 aminohapon pituisen PTPaasidomeenin. Niiden spesifinen katalyyttinen aktiivisuus on noin 1000-kertainen ja paljon epäspesifisempi kuin PTK:iden. Kuten PTK:tkin, PTPaasit voidaan jakaa transmembraanisiin ja sytoplasmisiin PTPaaseihin. Transmembraaniset PTPaasit sisältävät solunulkoisia alueita, joissa on motiiveja, kuten fibronektiinin tyypin III kaltaisia toistoja, kadheriinin kaltaisia toistoja ja immunoglobuliinin kaltaisia domeeneja. Niillä on yksi transmembraanin läpäisevä alue, jota seuraa yleensä kaksi PTPaasi-domeenia, joista vain toinen näyttää edistävän katalyyttistä aktiivisuutta. Kuten niiden solunulkoinen alue osoittaa, tietyt transmembraaniset PTPaasit, kuten PTPκ ja PTPμ, osallistuvat homofiiliseen solu-soluadheesioon, ja PTPμ saattaa vakauttaa solu-solukontakteja defosforyloimalla kateniineja ja kadheriineja. Näiden ja muiden transmembraanisten PTPaasien ei ole todettu osallistuvan RPTK:iden suoraan defosforylaatioon, toisin kuin sytoplasmiset PTPaasit, joista useat kykenevät suoraan defosforyloimaan RPTK:ita.

Hematopoieettisesti ilmentyvä, sytoplasminen proteiinityrosiinifosfataasi SHP-1 on yksi vain kahdesta tunnistetusta SH2-domeenin sisältävästä PTPaasista. SHP-1 sitoutuu aktivoituihin RPTK:ihin, kuten CSF-1:een ja Kit/SCF-reseptoriin, jommankumman SH2-domeeninsa kautta. SHP-1:n ja rakenteellisesti sukulaisen SHP-2:n (ks. myöhemmin) SH2-sitoutuminen vapauttaa PTPaasi-domeenin autoinhibitorisen rajoituksen. Näin ollen on osoitettu, että sekä CSF-1- että Kit/SCF-reseptorit ovat SHP-1:n suoria substraatteja ja että SHP-1 on tärkeä Kit- ja CSF-1-reseptorisignaalin normaalin alasäätelyn kannalta. Tällä on myös fysiologista merkitystä. Näin ollen hiirillä, joilla on motheaten (me) -fenotyyppi, joka johtuu SHP-1:n luonnossa esiintyvistä LOF-mutaatioista (loss-of-function), on lukuisia hematopoieettisia poikkeavuuksia, jotka johtuvat myelooisten/monosyyttisten ja syöttösolujen hyperproliferaatiosta. Säätyneen CSF-1:n ja Kit-reseptorin signaloinnin uskotaan aiheuttavan nämä viat, mitä tukevat tutkimukset, jotka osoittavat, että dominoivien white-spotting (W) -mutaatiohiirien, joilla on luonnossa esiintyviä LOF-mutaatioita Kitissä, fenotyyppiä lievittää risteytys me-mutaatiohiirien kanssa ja päinvastoin. Nämä ja uudemmat tiedot, jotka osoittavat vaihtoehtoisia transkripteja, jotka aiheuttavat joko SHP-1:n typistymiä tai frameshift-mutaatioita, jotka johtavat SHP-1:n häviämiseen leukemiapotilaista peräisin olevissa primaarisissa Kitiä ekspressoivissa kasvainsolulinjoissa, viittaavat siihen, että SHP-1 on kasvainsuppressori.

Proteiinityrosiinifosfataasi PTP1B on toinen sytosolista alkuperää oleva fosfataasi, joka on osallisena suorassa RPTK:n signaalinvälityksen alasäätelyssä. PTP1B sitoutuu aktivoituihin insuliini- ja IGF-1-reseptoreihin N-terminaalisen katalyyttisen domeeninsa kautta tuntemattoman mekanismin kautta. Sitouduttuaan PTP1B defosforyloi suoraan itse insuliinireseptorin ja sen tärkeimmän liitännäisproteiinin, insuliinireseptorin substraatti-1:n (IRS-1). Vastaavasti PTP1B:n kohdennettu poisto hiirissä aiheuttaa insuliinireseptorin ja IRS-1:n hyperfosforylaatiota ja insuliinisignaalin herkistymistä. PTP1B myös defosforyloi STAT5a:ta ja STAT5b:tä, mikä estää niiden ydintranslokaation ja transkriptioaktiivisuuden. STAT5a ja STAT5b fosforyloidaan sytokiinireseptorien aktivoimien JAK:ien toimesta, mutta ne fosforyloidaan myös suoraan useiden RPTK:iden toimesta.

PTP1B:n sekä reseptorin kaltaisen PTPα:n ja SHP-2:n, toisen SH2-domeenin sisältävän fosfataasin, on kuitenkin epäilty osallistuvan myös RPTK:iden alavirtaan suuntautuvan signaloinnin tehostamiseen. PTP1B:tä yliekspressoidaan rintasyöpäsolulinjoissa, joissa se aiheuttaa Tyr527:n defosforylaatiota c-Src:n C-päätteessä. Tämä johtaa Src-kinaasiaktiivisuuden lisääntymiseen, sillä tämän kohdan fosforylaatio estää Src-aktiivisuutta allosterisen, autoinhibitorisen mekanismin kautta. Transmembraaninen RPTPα fosforyloituu in vivo tyrosiinifosforyloidulla Tyr789:llä, joka luo sitoutumiskohdan c-Src:lle, jolloin RPTPα voi defosforyloida Src:n Tyr527:n in vitro. Mielenkiintoista on, että sekä Src:n sitoutuminen että sen defosforylaatio ovat riippuvaisia Tyr789:n fosforylaatiosta, ja RPTPα:n suorittamalle Src:n aktivoinnille on ehdotettu fosfotyrosiinin siirtymismekanismia. Vastaavasti RPTPα:n kinaasivirheelliset tai Tyr789Phe-mutantit kumoavat neoplastisen transformaation yliekspressoidulla RPTPα:lla, ja RPTPα:n kohdennettu häirintä aiheuttaa Src-perheen jäsenten aktiivisuuden vähenemisen mutanttihiirten soluissa, mikä korreloi Tyr527:n fosforylaatiotasojen nousun kanssa. SHP-2, joka ilmentyy ubiikkisesti, assosioituu in vivo SH2-domeeniensa kautta lukuisiin RPTK- ja PTK-substraatteihin, kuten PDGF:n, EGF:n, insuliinin kaltaisen kasvutekijä-1:n (IGF-1) ja SCF:n reseptoreihin sekä telakoituvaan proteiiniin IRS-1:een. SHP-2 tyrosiinifosforyloituu vasteena useiden kasvutekijöiden aiheuttamalle stimulaatiolle, ja tyrosiinifosforyloitunut SHP-2 sitoutuu joko PDGF:n tai SCF:n reseptoreihin sekä adaptorimolekyyliin Grb2. Sitoutuneen SHP-2:n on puolestaan osoitettu selektiivisesti defosforyloivan PDGFR-β:n tyrosiinijäämiä, jotka ovat tärkeitä PI 3′-kinaasin ja Rasin GAP:n sitoutumiselle. Lisäksi SHP-2:n salpaavien vasta-aineiden mikroinjektio tai SHP-2:n SH2-domeenin tai katalyyttisesti inaktiivisen SHP-2:n ilmentäminen estää EGF:n, insuliinin ja IGF-1:n stimuloimaa mitogeneesiä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että SHP-2 on Ras-signaloinnin ja muiden Grb2:n säätelemien signaalireittien ylävirran aktivaattori ja mahdollisesti RPTK:n indusoiman PI 3′-kinaasi-signaloinnin modulaattori. SHP-1:n tavoin SHP-2:n sitoutuminen saattaa aktivoida sen katalyyttisen toiminnan. SHP-2:n väitetään myös defosforyloivan Src:n C-päätteessä olevan Tyr527:n, mikä tarjoaa positiivista lisäsäätelyä signaloinnille.

Suurin seriini/treoniinispesifinen fosfataasi PP2A defosforyloi useita proteiiniseriini-/treoniinikinaaseja ja niiden substraatteja. Tämä on sytoplasman ja ytimen heterotrimeerinen fosfataasi, joka koostuu rakenteellisesta A-alayksiköstä. säätelykykyisestä B-alayksiköstä ja katalyyttisestä C-alayksiköstä. PP2A on sidottu lukuisiin telineproteiineihin säätelykykyisen alayksikkönsä kautta, ja sen aktiivisuutta säädellään tiukasti koottujen telineiden yhteydessä. Yksi tärkeistä substraateista RPTK-signaloinnissa on PI 3′-kinaasin kohdeakt Akt, joka on proteiinien seriini/treoniinikinaasi, joka välittää solujen eloonjäämistä osittain Bcl-2-perheen jäsenen Badin fosforylaation kautta. PP2A defosforyloi Aktin aktivoivan fosforylaatiokohdan T308, joka on tärkeä kinaasiaktiivisuuden kannalta. Lisäksi PP2A saattaa defosforyloida antiapoptoottisen molekyylin Bcl-2:n, mikä kumoaa sen eloonjäämisfunktion. PP2A:lle on tunnistettu lukuisia muita substraatteja, joista monet ovat tärkeitä RPTK:iden myöhemmän vaiheen kohteita.

Kaksi fosfoinositidispesifistä fosfataasia, PTEN ja SHIP1/2, defosforyloivat spesifisesti inositolirenkaan D-3- ja D-5-aseman PtdIns(3,4,5,5)P3:ssa, joka on yksi tärkeimmistä PI 3′-kinaasi-signaalin välittämisen tehostajista. Tämä kumoaa RPTK:n käynnistämän PI 3′-kinaasi-signalisaation, ja sen vuoksi PTEN:n on osoitettu olevan usein mutatoitunut ihmisen kasvainsuppressorigeeni. PTEN:n inaktivoivilla mutaatioilla on merkitystä tietyissä ihmisen hermosolu-, rinta- ja sukusolukasvaimissa, mikä liittyy Aktin lisääntyneeseen aktiivisuuteen.