Caco-2:n läpäisevyysmääritys

Kysymyksiä ja vastauksia Caco-2:n läpäisevyydestä

Anna yleiskatsaus Cyprotexin Caco-2:n läpäisevyysmääritykseen.

Caco-2-soluja käytetään laajalti in vitro -mallina ihmisen lääkeaineiden imeytymisen ennustamisessa. Caco-2-solulinja on peräisin ihmisen paksusuolen karsinoomasta, ja viljeltäessä solut erilaistuvat spontaanisti polarisoituneiden enterosyyttien monokerroksiksi.

Solut kylvetään multiwell-insert-levyille, ja ne muodostavat konfluentin monokerroksen 20 päivää ennen koetta. Päivänä 20 testattava yhdiste lisätään kalvon apikaalipuolelle ja yhdisteen virtausta monokerroksen läpi seurataan 2 tunnin ajan. Lääkkeen effluksin tutkimiseksi on myös tutkittava yhdisteen kulkeutumista basolateraalisesta lokerosta apikaaliseen lokeroon.

Läpäisevyyskerroin (Papp) lasketaan seuraavasta yhtälöstä:

Jossa dQ/dt on lääkkeen läpäisynopeus solujen läpi, C0 on luovuttajan konsentraatio ajanhetkellä nolla ja A on solun monokerroksen pinta-ala.

Miten tulkitsen Caco-2:n läpäisevyysmäärityksestä saatuja tietoja?

Caco-2:n läpäisevyysmäärityksestä saatuja tietoja voidaan käyttää usealla eri tavalla. Ensinnäkin yhdisteet voidaan asettaa paremmuusjärjestykseen niiden Papp-arvojen perusteella. Kaksi vertailuyhdistettä, atenololi (passiivinen parasellulaarinen kulkeutuminen) ja propranololi (passiivinen transsellulaarinen kulkeutuminen), seulotaan testiyhdisteiden rinnalla. Atenololin ja propranololin tiedetään imeytyvän ihmisiin 50 %:lla ja 90 %:lla2,3 , ja niitä voidaan käyttää merkkiaineina testiyhdisteiden luokittelussa. Toiseksi tietoja voidaan käyttää yhdessä muiden in vitro -parametrien kanssa ennustamaan yhdisteen oraalista farmakokinetiikkaa in vivo Cloe PK -simulointiohjelmiston avulla. Kolmanneksi Caco-2-dataa voidaan käyttää ennustamaan veri-aivoesteen (BBB) läpäisevyyttä (kuva 3).

Kuva 3
Korrelaatio Caco-2:sta johdetun Pactive-arvon ((PappB-A – PappA-B)/2) ja BBB:n läpäisevyysnopeuden, logPS (läpäisevyys-pinta-alan tulo), välillä in situ. Lääkeaineiden, joiden tiedetään läpäisevän BBB:n (kofeiini, imipramiini, progesteroni) logPS >-2,0 (vihreällä varjostettu alue), kun taas lääkeaineiden, joiden tiedetään olevan sellaisia, että ne eivät läpäise BBB:tä (aldosteroni, hydrokortisoni, simetidiini), logPS ≤-3,5 (vaaleanpunainen varjostettu alue).

Tässä on esitetty regressiosuora, joka osoittaa selkeän korrelaation Pactive- ja logPS-arvojen välillä sellaisten yhdisteiden osalta, joiden efflux-aktiivisuus Caco-2-soluissa ei ole merkittävä, ts, yhdisteille, joiden Pactive on < 5 × 10 -6 cm/s. Tämän korrelaation avulla Cyprotexin Caco-2-määritystä voidaan käyttää arvioitaessa BBB-potentiaalia yhdisteille, joiden Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.

Mikä on Caco-2:n läpäisevyyden ja ihmisen suoliston imeytymisen välinen suhde?

Caco-2:n läpäisevyyden (käyttäen pH7,4 HBSS-puskuria sekä apikaalisessa että basolateraalisessa kompartimentissa) ja ihmisen suoliston imeytymisen välinen suhde on esitetty kuvassa 4. Tämä korrelaatio on tyypillinen kirjallisuudessa näiden kahden muuttujan osalta havaituille korrelaatioille4. On tärkeää huomata, että suoliston imeytymistietojen tarkkuus vaikuttaa tähän kuvaajaan. Tässä kuvaajassa käytetyt suoliston imeytymisarvot ovat peräisin Zhao et al. 20012:sta. Tässä asiakirjassa ihmisen suoliston imeytymistä koskevat tiedot on saatu eri lähteistä, ja niiden laatu vaihtelee huomattavasti. Useilla yhdisteillä tiedetään myös olevan annosriippuvainen imeytyminen (esitetty kuvaajan virhepalkkeina).

Kuva 4
Caco-2 -läpäisevyyden ja ihmisen suoliston imeytymisen %:n välinen suhde.

Mitä eroja on PAMPA:n ja Caco-2:n läpäisevyysmäärityksen välillä?

Caco-2:n läpäisevyysseulan katsotaan edustavan paremmin ihmisen imeytymistä in vivo kuin PAMPA:n (rinnakkainen keinotekoinen kalvon läpäisevyysmääritys). PAMPA:lla mitataan ainoastaan passiivista diffuusiota, kun taas Caco-2-malli ennustaa paremmin ihmisen imeytymistä sellaisten yhdisteiden osalta, joilla on aktiivista imeytymistä tai poistumista tai jotka kulkevat kalvon läpi parasellulaarista reittiä. Molemmista määrityksistä saadut tiedot, joita käytetään yhdessä, voivat olla arvokkaita huonon imeytymisen perimmäisen syyn tunnistamisessa.

Miten mittaan lääkeaineen effluksin?

Toteutetaan kaksisuuntainen Caco-2:n läpäisevyysmääritys, jossa yhdisteen kulkeutuminen mitataan apikaalista basolateraaliseen suuntaan sekä basolateraalisesta apikaaliseen suuntaan. Tulos ilmoitetaan yleensä effluksisuhteena eli Papp(B-A)/Papp(A-B). Jos effluksisuhde on suurempi kuin kaksi, tämä osoittaa, että lääkeaineen effluksi tapahtuu. Talinololia, tunnettua P-gp:n substraattia, seulotaan kontrolliyhdisteenä sen varmistamiseksi, että solut ilmentävät toimivia effluksikuljettajaproteiineja.

Miten tiedetään, ovatko solut muodostaneet konfluentin monokerroksen?

Transsepiteliaalisen sähköisen resistanssin (TEER) mittausta käytetään määrittämään solujen välisten tiukkojen liitosten muodostuminen. Lisäksi luciferikeltainen, kalvon eheyden merkkiaine, inkuboidaan koeyhdisteen kanssa kokeen alussa. Jos luciferikeltaisen Papp-arvo ylittää 1,0 × 10 -6 cm/s yhdessä kuopassa, mutta testattavan yhdisteen tai kontrolliyhdisteen johdettu Papp-tulos kyseisessä kuopassa on laadullisesti samankaltainen kuin jäljelle jäävissä toistokuopissa määritetty tulos (luciferikeltaisen kynnysarvon sisällä), solumonokerrosta voidaan vastuullisen tutkijan tieteellisen arvion perusteella pitää hyväksyttävänä. Jos näin ei ole, kyseisestä monokerroksesta saatu tulos suljetaan pois ja ilmoitetaan tulos n=1 tai yhdiste voidaan testata uudelleen. Jos molemmissa jäljennöksissä on virhe, yhdiste seulotaan uudelleen. Jos molemmat luciferikeltaisen Papp-arvot epäonnistuvat saman yhdisteen osalta kahdella eri kerralla, oletetaan, että yhdisteellä on joko sytotoksisia vaikutuksia Caco-2-soluja vastaan tai luontaista fluoresenssia.

Miten ja miksi %:n saanto lasketaan?

%:n saantoa voidaan käyttää hyödyksi tulkittaessa Caco-2:n tietoja. Jos saanto on hyvin alhainen, se voi viitata ongelmiin, jotka liittyvät huonoon liukoisuuteen, yhdisteen sitoutumiseen levyyn, Caco-2-solujen metaboliaan tai yhdisteen kertymiseen solun monokerrokseen.