F-Aktin

Kristallstruktur von F-Aktin, 2zwh

Filamentöse Aktin-Einheiten (F-Aktin) werden auch als Mikrofilamente bezeichnet und sind hoch konservierte, proteinhaltige Komponenten, die nahezu ubiquitär in eukaryotischen Zytoskeletten vorkommen. F-Aktin und andere Aktinproteine haben im Allgemeinen strukturelle Aufgaben in Zellen.

Einleitung

Aktin kommt in fast allen eukaryotischen Zellen vor und ist vor allem für seine Funktion als Struktur- und Translokationsprotein bekannt. Es hat auch eine ATPase-Funktion, da es ATP zu ADP und Pi hydrolysiert und bei jeder Hydrolyse eine Konformationsänderung erfährt. Aufgrund seiner nukleotidabhängigen Konformationsänderung gehört Actin zur Actin-Superfamilie, zu der auch andere Proteine wie Hsp70(DnaK), Hsc70 und Hexokinase gehören. Aufgrund der Ähnlichkeit von Hsc70 und der ATPase-Domäne von Aktin in Escherichia Coli wird angenommen, dass die beiden Proteine einen gemeinsamen Ursprung haben. Prokaryonten haben zwar kein Aktin, dafür aber ein Aktin-Homolog, MreB, was ebenfalls auf eine mögliche gemeinsame Abstammung hindeutet.

Actin kommt in zwei Formen vor: globuläres Actin (G-Actin), die freien monomeren Einheiten des Actins, und filamentöses Actin (F-Actin), die Polymerform. Diese beiden Formen stehen in einem dynamischen Gleichgewicht zueinander, da in der Zelle ständig eine ATP-vermittelte Polymerisation und Depolymerisation stattfindet. Die Monomereinheiten im F-Aktin besitzen eine Form, die sich von der freien monomeren Form unterscheidet, und es ist ein Ergebnis dieser Veränderung, dass die spezifischere ATPase-Aktivität beobachtet werden kann.

Zusammenbau

(1J6Z).

G-Aktin ist die freie monomere Form von Aktin, die zu F-Aktin polymerisiert. Die Strukturen von globulärem und filamentösem Aktin unterscheiden sich in vielerlei Hinsicht voneinander, obwohl das G-Aktin aus F-Aktin besteht. Wenn das monomere Aktin zu F-Aktin polymerisiert wird, wird die Einheit abgeflacht. Außerdem besitzt das F-Aktin eine ATPase-Funktion, die beim G-Aktin minimal ist. Die Domänen und die aktive Stelle sind in Bezug auf die Bestandteile gleich und werden später in Bezug auf das F-Actin-Monomer diskutiert.

G-Actin scheint mehr Liganden in seiner Struktur zu haben, die außerhalb des aktiven Zentrums liegen. Es wird angenommen, dass nur 3 der 5 Liganden tatsächlich in Lösung vorhanden sind und zur Polymerisation von G-Actin zu F-Actin beitragen. Diese Darstellung von G-Actin weist auch ein Molekül auf, das in einigen kristallinen Actin-Strukturen zu finden ist, aber nicht unbedingt. Das beobachtete Molekül an Cys374 wurde verwendet, um die Polymerisationsaktivität zu blockieren, so dass der Kristall von G-Actin beobachtet werden konnte

Die Bildung von F-Actin ist ein dynamischer Prozess des Auf- und Abbaus, der als „Tretmilling“ bezeichnet wird. Der Übergang zwischen G- und F-Aktin beginnt mit einem stabilisierten Oligomer aus ATP-Aktin-Einheiten, das durch ein Faltungsmuster vom Typ Nukleation-Kondensation gebildet wird. Anschließend erfolgt die Anlagerung von ATP-Monomer-Einheiten an beide Enden, wobei jedoch aufgrund der unterschiedlichen Ladungspolarität der beiden Enden die Anlagerung an das so genannte „Plus- (+) Ende“ oder „Widerhakenende“ bevorzugt wird. Am gegenüberliegenden Ende, dem „Minus (-)-Ende“ oder dem „spitzen Ende“, kommt es zu einer bevorzugten Dissoziation von Aktineinheiten.

Nach der Bindung des ATP-gebundenen Aktins findet eine Hydrolyse des ATP statt, wodurch der ADP- und Pi-gebundene Zustand entsteht. Der anschließende Verlust eines Pis führt zum ADP-Actin-Zustand. Da die Möglichkeit besteht, dass an beiden Enden monomere Einheiten hinzugefügt oder entfernt werden, kann der Aufbau von F-Aktin als Gleichgewichtsprozess beschrieben werden. Da jedoch die Geschwindigkeit der ATP-Actin-Assoziation zehnmal so hoch ist wie die der ADP-Actin-Dissoziation, scheint sich das F-Actin vorwärts zu bewegen oder zu „treadmilling“. ADP-Actin-Monomere dissoziieren am Minus-Ende und werden zu ATP-Actin recycelt, so dass die Polymerisation am Plus-Ende erneut stattfinden kann.

Struktur

Geschichte der Struktur

Das F-Actin-Protein wurde 1942 von Straub entdeckt. Die Struktur wurde auf der Grundlage einer 1990 von Holmes et al. gefundenen Röntgenkristallographie mit geringer Auflösung spekuliert, und im Laufe der Zeit wurde das „Holmes-Modell“ akzeptiert. Im Gegensatz dazu wurde die G-Actin-Struktur über 30 Mal unabhängig voneinander bestimmt. Ein höher aufgelöstes F-Actin-Modell wurde erst im Dezember 2008 von Oda et al. in der PDB-Datenbank hinterlegt.

F-Actin Monomer und Polymer

(2zwh)

Monomer

Jede monomere F-Actin-Einheit hat als Teil ihrer Tertiärstruktur mehrere Schleifen, die für ihren Zusammenbau zum polymeren F-Actin wichtig sind. Diese Schleifen ändern ihre Konformation je nach dem Zustand des gebundenen Nukleotids oder dienen als Bindungsstellen für benachbarte monomere Aktineinheiten. Sie fungieren als „Schalter“ für Konformationen, die vom gebundenen Nukleotid abhängen. Die Reste der DNAse I-Bindungsschleife (40-50) unterliegen nicht nur Konformationsänderungen, die sich auf die Stabilität auswirken, sondern binden auch DNAse I-Enzyme und halten vermutlich die DNAse I fest. Die hydrophobe Schleife, die sich über die Reste 264-273 erstreckt, und die Schleife, die sich über die Reste 165-172 erstreckt, fungieren als Stellen, an die benachbarte monomere Aktin-D-Schleifen binden können. Eine ähnliche Funktion haben die Reste (374-375).

Das hier gezeigte F-Actin-Molekül besteht aus 375 Resten (43kDa) und zwei Liganden, ADP und Ca2+. Es hat zwei Hauptdomänen, die durch eine Nukleotid-Bindungsspalte getrennt sind. Je nach dem Zustand des gebundenen Nukleotids ändert sich die stabilste Konformation von F-Aktin. Im Zustand der ATP- und ADP+Pi-Nukleotidbindung hat es einen geschlossenen Bindungsspalt. In seinem nur an ADP gebundenen Zustand hat es einen breiteren BindungsspaltEin charakteristisches Merkmal von Aktin ist, dass die Domänen trotz der nukleotidzustandsabhängigen Konformationsänderungen zueinander verdreht bleiben.

F-Actin-Polymer (basierend auf der F-Actin-Struktur von Ken Holmes)

Polymer

F-Actin hat das Aussehen von zwei rechtshändigen Helices, die sich allmählich umeinander drehen. In Wirklichkeit besteht es aus Wiederholungen von 13 Aktineinheiten für jeweils 6 linkshändige Windungen, die sich über eine Länge von 350 Å erstrecken.

Nukleotidzustandsabhängige Konformationsänderungen

Der Zustand des gebundenen phosphorylierten Nukleotids beeinflusst die Konformation des F-Aktin-Monomers. Das Vorhandensein eines Gamma-Phosphats im aktiven Zentrum bewirkt die Rotation eines Ser14-Rests. Diese Veränderung führt dazu, dass ein methyliertes Histidin (HIC73) verschoben wird, was die aktive Stelle des F-Actins verändert und eine Konformationsänderung in der D-Schleife bewirkt. Das HIC73 befindet sich in der „Sensorschleife“ oder dem „Schalter“ für die Verknüpfung von Änderungen des gebundenen Nukleotids mit Konformationsänderungen. In ATP-Actin und ADP-Pi-Actin ist die D-Schleife unstrukturiert. In der ADP-gebundenen Form von F-Aktin ist in der D-Schleife des Monomers in der Regel eine Alpha-Helix zu erkennen.

Obwohl die Alpha-Helix in diesem Oda-Modell von F-Aktin nicht beobachtet wird und auch in einigen anderen F-Aktin-Studien nicht zu sehen ist, wird von Oda et al. eingeräumt, dass die experimentellen Ergebnisse zu einer verlängerten Alpha-Helix im Modell geführt haben könnten, im Gegensatz zu einem verlängerten ungeordneten Strang als interagierendes Segment zwischen F-Aktin-Monomereinheiten.

Domänen

(2zwh)

Die Struktur einer einzelnen Einheit von F-Aktin ergibt sich aus einer Polypeptidkette mit zwei Domänen. Der Nukleotidbindungsspalt, der Ort der ATP-Hydrolyse, kann zwischen den beiden Domänen beobachtet werden. Die Bewegung der Domänen ermöglicht die offenen und geschlossenen F-Aktin-Konformationen.

Die Bewegung der Domänen wird durch die Rotation um das lila dargestellte , ermöglicht. Nach Oda et al. soll sich Domäne 2 während des Übergangs von G- zu F-Aktin um 20° neigen und sich an Domäne 1 anpassen, wodurch eine flachere Konformation als das freie G-Aktin entsteht. Es ist nicht sicher, ob diese Abflachung vor oder nach der ATP-Hydrolyse erfolgt. Holmes liefert ein vereinfachtes Bild dieser Domänenbewegung und Abflachung.

Stabilität

Die abgeflachte, gefaltete Form von F-Aktin erfordert andere Stabilisierungsmechanismen als die freie, monomere G-Aktin-Form. Die Stabilität des F-Actin-Komplexes wird durch eine Reihe von Faktoren wie Arginin 206, 183, 177 (violett), Glutamat 72 (blau), Aspartat 187 (grün), 179 und 4-Methylhistidin 73 (gelb) erreicht. Es wird angenommen, dass die zusätzliche Stabilität durch eine Unterbrechung der Interaktion zwischen den Resten in der gleichen Hälfte ihrer jeweiligen Domänen zu einer neuen Interaktion führt, bei der ein viel größerer Abstand zwischen ihnen beobachtet wird.

Wenn das Pi freigesetzt wird, führt eine Konformationsänderung an der D-Schleife zu einer „Erweichung“ des F-Aktinfilaments. Das heißt, das ADP-Actin-Monomer wird instabiler und anfälliger für die Abspaltung

Aktive Stelle

Nach der Actin-Bindung am Plus-Ende des Actin-Filaments wird die ATPase-Funktion aktiviert. Die Konformationsänderung von G- zu F-Actin fördert die katalytische Aktivität aufgrund der 20°-Verschiebung, die zu einer geschlosseneren Bindungsstelle führt; diese Konformationsänderung wird auch durch die diagonale Subdomänen-Interaktion zwischen Leu110 und Thr194 stabilisiert. Als Ergebnis dieser Konformationsänderungen wird das Aktin näher an den ATP-Ca2+-Liganden herangeführt. Gln137 enthält ein Wassermolekül, und die Nähe zum ATP ermöglicht die Spaltung des Gamma-Phosphats. Die Freisetzung des anorganischen Phosphats erfolgt über die Konformationsänderung der flexiblen „D-Schleife“ in eine geordnete Alpha-Helix (obwohl dies in diesem Modell nicht gezeigt wird).

Funktion

F-Actin erfüllt in eukaryotischen Zellen strukturelle, mechanische und enzymatische Aufgaben. Diese Funktionen schließen sich nicht unbedingt gegenseitig aus.

Die dynamischen Funktionen von F-Aktin sind stark an der Zellmigration beteiligt.

Zytoskelett

F-Aktin ist der am häufigsten vorkommende Bestandteil des Zytoskeletts von Eukaryoten. In Anbetracht seiner geringen Größe bietet es eine große Menge an Zugfestigkeit. In Fällen, in denen die Flexibilität als strukturelle Komponente nicht erwünscht ist, können Vernetzungen zwischen F-Actin-Polymeren gebildet werden, um eine größere Steifigkeit und Unterstützung zu erreichen.

Die Verlängerung der F-Actin-Verzweigungen führt zu dem Phänomen, dass die Plasmamembran bei der lamellopodialen und filopodialen Ausdehnung nach vorne geschoben wird. Dieser Prozess beruht auf dem dynamischen Gleichgewichtszustand, in dem sich G- und F-Aktin befinden, da die kontinuierliche Polymerisation von Aktineinheiten an der Vorderkante die Membranausdehnung vorantreibt. Ohne die enzymatische ATPase-Funktion des F-Aktins wäre dieser Prozess nicht möglich.

Aktin-Myosin

Die relativ flachere Form von F-Aktin im Vergleich zu G-Aktin ermöglicht es Myosin, bevorzugt F-Aktin gegenüber G-Aktin zu binden. Das bedeutet, dass F-Aktin, nicht G-Aktin, die funktionelle Form von Aktin ist. Es bildet zusammen mit Myosin einen großen Teil der dünnen Filamente, die für die Muskelkontraktionen verantwortlich sind. Die Struktur des F-Aktins verleiht ihm einen großen Widerstand gegen große Kräfte, wie sie bei der Muskelkontraktion auftreten.