EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms

Overview of EzColocalization workflow

Der Workflow für EzColocalization ist in vier Module unterteilt, die jeweils eine eigene Registerkarte auf der GUI haben. Die Registerkarten sind: (i) „Inputs“, wo Bilder, Masken oder ROI-Listen (regions of interest) ausgewählt und ausgerichtet werden; (ii) „Cell Filters“, wo Zellen auf der Grundlage physikalischer Merkmale und der Signalintensität ausgewählt werden können; (iii) „Visualization“, wo Heatmaps, Scatterplots und metrische Matrizen (siehe unten) erstellt werden; und (iv) „Analysis“, wo die Kolokalisierungsmetriken und -ergebnisse ausgewählt werden. Es müssen nicht alle Module und nicht alle Prozesse innerhalb eines Moduls verwendet werden. Einige Registerkarten haben eine Schaltfläche „Vorschau“, um ein bestimmtes Modul auszuführen, anstatt der Schaltfläche „Analysieren“, die alle ausgewählten Prozesse in allen Modulen ausführt.

Eingaben

Die Bilddateien, die auf der Registerkarte „Eingaben“ (Abb. 1A) ausgewählt werden, müssen sein: (i) monochromatisch (d. h. keine RGB- oder CMYK-Formate); (ii) 8-Bit, 16-Bit oder 32-Bit; und (iii) in einem Format wie TIFF, das die ursprünglichen Pixelintensitätswerte beibehält. Große Bilder können für die Dateiübertragung mit einem verlustfreien Format wie ZIP oder LZW komprimiert und anschließend für Analysen dekomprimiert werden. Zusätzlich zu den Bildern kann EzColocalization Masken und ROI-Listen zur Zellidentifizierung akzeptieren (siehe unten). Wenn für jeden Kanal mehrere Bilder vorhanden sind, sollten die Bilder zur effizienteren Analyse im Menü „Stack“ gestapelt werden (weitere Einzelheiten siehe ImageJ-Anleitung24). Bei den Bildern in einem Stapel kann es sich um verschiedene Sichtfelder oder eine Zeitreihe handeln, sie müssen jedoch für jeden Kanal dieselben Abmessungen, dieselbe Vergrößerung und dieselbe Bildreihenfolge aufweisen. Auf der Eingaberegisterkarte können Sie außerdem Schwellenwerte für die Signalintensität festlegen und falsch ausgerichtete Bilder aus verschiedenen Kanälen ausrichten (Abb. 1B und ergänzende Informationen). Empfehlungen für die Aufnahme geeigneter Bilder für die Kolokalisationsanalyse finden Sie in den ergänzenden Informationen. Hinweis: Die Ausrichtung basiert auf der Annahme, dass ein geeigneter Schwellenwert für die Signalintensität gewählt werden kann, um zwischen Pixeln innerhalb und außerhalb von Zellen zu unterscheiden; wenn der Schwellenwert Bereiche außerhalb der Zelle oder nur einen begrenzten Bereich innerhalb von Zellen einschließt, funktioniert die Ausrichtung möglicherweise nicht richtig. Aus diesem Grund sollten alle Ausrichtungen visuell überprüft werden, indem die ROIs untersucht werden, um zu bestätigen, dass geeignete Zellbereiche ausgewählt wurden.

EzColocalization ist in erster Linie für einen „Zellidentifizierungs“-Kanal und zwei oder drei „Reporter“-Kanalbilder konzipiert. Es kann jedoch auch mit anderen Eingangskombinationen arbeiten (Tabelle S1). Der Zellidentifizierungskanal dient der Identifizierung einzelner Zellen und damit der Unterscheidung zwischen intrazellulären und extrazellulären Pixeln. Der Zellidentifizierungskanal kann jede Art von Bild sein, die eine Identifizierung der Zellgrenzen ermöglicht, einschließlich: Lichtmikroskopische Bilder (z. B. Phasenkontrast25,26 und Hellfeld), Bilder mit einem Reporter, der die Zellmembran oder das gesamte Zytoplasma markiert (z. B. Cy5, Abb. 1B), und Bilder mit einem extrazellulären Farbstoff, der Zellen umreißt. Bilder mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC) erzeugen Schatten, die eine automatische Auswahl von Zellen mit Hilfe von Schwellenwertmethoden erschweren27. Daher empfehlen wir für DIC-Bilder die Erstellung von ROIs mit Hilfe der „Auswahlwerkzeuge“ in ImageJ, um Zellbereiche manuell zu umreißen und sie dann durch Auswahl von „Zum Manager hinzufügen“ (im Untermenü „Auswahl“ des Menüs „Bearbeiten“) zu einer Liste hinzuzufügen. Sobald die ROIs für alle interessierenden Zellen in einem Bild ausgewählt sind, kann mit den Funktionen „Clear Outside“ und „Autothreshold“ von ImageJ eine binäre Maske erstellt werden.

Zellfilter

Die Registerkarte „Zellfilter“ wird verwendet, um die Auswahl von Zellen in Bildern zu unterstützen (Abb. 2A) und intrazelluläre und extrazelluläre Pixel zu unterscheiden. Zellen werden identifiziert durch: (i) Auswahl eines der ImageJ-Schwellenwertalgorithmen24 oder manuelle Auswahl der Schwellenwerte (durch Auswahl von „*Manuell*“ aus einer Dropdown-Liste auf der Registerkarte „Eingaben“ und Drücken der Schaltfläche „Schwellenwert(e) anzeigen“), um Regionen zu identifizieren, die Zellen im Zellidentifikationskanal entsprechen (Abb. 2B). 2B); (ii) Verwendung der Wasserscheibensegmentierung zur Trennung von sich berührenden Objekten in den Bildern des Zellidentifikationskanals (optional) (Abb. 2B); (iii) Auswahl von Objekten aus den Bildern des Zellidentifikationskanals auf der Grundlage physikalischer Parameter (Abb. 2C) und der Signalintensität (Abb. 2D). EzColocalization versucht, anhand der Schiefe automatisch zu erkennen, ob die eingegebenen Bilder einen dunklen oder hellen Hintergrund haben. Unter der Annahme, dass sich mehr Pixel im Hintergrund als in den Zellen befinden, deutet ein Bild mit positiver Schiefe auf einen dunklen Hintergrund hin und eine negative Schiefe auf einen hellen Hintergrund. Der Benutzer kann auch manuell auswählen, ob die Eingabebilder einen dunklen oder hellen Hintergrund haben, und zwar in den Optionen „Parameter…“ des Menüs „Einstellungen“. Zellen, die nur teilweise innerhalb eines Bildes liegen und daher irreführende Werte liefern könnten, werden automatisch aus der Analyse entfernt.

EzColocalization verfügt über einen optionalen „Pre-Watershed-Filter“ und acht optionale Post-Watershed-Filter (mit der Möglichkeit, weitere auszuwählen). Die Watershed-Segmentierung kann die Trennung von sich teilenden und sich berührenden Zellen erleichtern28 , sie kann aber auch große Objekte wie Aggregate von extrazellulärem Material in kleinere Fragmente aufteilen, die die gleiche Größe wie Zellen haben. Um Letzteres zu vermeiden, kann der Filter Pre-watershed verwendet werden, um Objekte mit großen Flächen von der Analyse auszuschließen. Mit der Schaltfläche Vorschau auf der Registerkarte Zellfilter kann der Benutzer sehen, welche Objekte auf dem aktuellen Bild ausgewählt werden, wenn die minimalen und maximalen Grenzen aller Filter angepasst werden. Es gibt zwei Klassen von Parametern für die Post-Watershed-Zellenfilter (Tabelle S2): (i) physikalische Parameter, die auf Messungen aus dem Zellidentifikationskanal basieren, und (ii) Signalintensitätsparameter aus den Reporterkanälen. Die physikalischen Parameter gelten für alle Kanäle, während die Signalintensitätsparameter nur für den Reporterkanal gelten, für den sie ausgewählt wurden (da die Reporter sehr unterschiedliche Signalstärken haben können). Zusätzlich zur Filterung auf der Grundlage vordefinierter Optionen in ImageJ verfügt EzColocalization über Filter für das „MeanBgndRatio“ oder „MedianBgndRatio“, die berechnet werden, indem die mittlere oder mediane Signalintensität von Pixeln innerhalb eines Objekts durch die entsprechende mittlere oder mediane Signalintensität von extrazellulären Pixeln geteilt wird.

Visualisierung

Die Registerkarte „Visualisierung“ zeigt Signale oder Metriken in Zellen als: (i) „Heatmaps“, (ii) Scatterplots und (iii) „metrische Matrizen“ (Abb. 3A).

Heatmaps sind Pseudofarbbilder, die die relative Größe der Reportersignale zeigen (Abb. 3B). Sie werden durch Normalisierung und Neuskalierung erzeugt, so dass die minimalen und maximalen Pixelwerte in jeder Zelle, jedem Bild oder Stapel 0 bzw. 255 sind. Es gibt acht Optionen für die Einfärbung der Heatmaps, und die Intensitätswerte für jede Farbe erhält man über die Funktion „Show LUT“ (im Untermenü „Color“ des Menüs „Image“ in ImageJ). Zell-Heatmaps eignen sich, um festzustellen, wo jeder Reporter in den Zellen mit der höchsten Intensität auftritt. Bild-Heatmaps können zeigen, ob verschiedene Zellen innerhalb eines Sichtfeldes deutlich unterschiedliche Intensitäten aufweisen, was auf biologische Heterogenität oder Ungleichmäßigkeit bei der Markierung hinweisen kann. Stapel-Heatmaps können zeigen, ob Zellen in verschiedenen Bildern deutlich unterschiedliche Signalintensitäten aufweisen, was auf Ungleichmäßigkeiten bei der Markierung oder bei Messungen auf einem Objektträger (z. B. aufgrund von Photobleiche) oder auf Signalveränderungen im Laufe der Zeit (wenn es sich bei dem Stapel um eine Zeitreihe handelt) hinweisen kann. Hinweis: Das Erscheinungsbild der Heatmap wird durch die Helligkeits- und Kontrasteinstellungen beeinflusst.

Scatterplots zeigen die Beziehung zwischen der Signalintensität für zwei oder drei Reporterkanäle für einzelne Zellen und Bilder (Abb. 3C). Diese Beziehung ist wichtig für die Wahl der geeigneten Kolokalisationsmetrik (siehe ergänzende Informationen). Streudiagramme können auch Heterogenität in den Lokalisierungsmustern8 aufzeigen, was die Entfernung von Hintergrundpixeln oder separate Analysen für verschiedene Zelltypen erforderlich machen kann.

Metrische Matrizen geben einen Überblick über die Lokalisierungsmuster, indem sie die berechneten Werte einer Kolokalisierungsmetrik für viele Schwellenwertkombinationen zeigen. Metrische Matrizen für den Threshold Overlap Score (TOS) haben sich als nützlich für die Analyse von Lokalisierungsmustern für zwei Reporterkanäle erwiesen8,15 (Abb. 3D). Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, dass EzColocalization die Möglichkeit bietet, metrische Matrizen für zwei Reporterkanäle unter Verwendung von fünf weiteren Metriken zu berechnen: Schwellenwert-Überlappungsscore mit logarithmischer Skalierung8, Pearson-Korrelationskoeffizient (PCC), Manders-Kolokalisierungskoeffizienten (M1 und M2), Spearman-Rangkorrelationskoeffizient (SRCC) und Intensitätskorrelationsquotient (ICQ)8,15. Die Kolokalisierung für drei Kanäle kann auch mit ICQ, Manders‘ Kolokalisierungskoeffizienten und TOS29 gemessen werden (ergänzende Informationen).

Die Schwellenwerte für alle Metriken werden als oberstes Perzentil (FT) der Pixel für die Signalintensität gemessen8,15. FT = 0,1 sind beispielsweise die 10 % der Pixel mit dem höchsten Signal. Für die metrischen Matrizen wird FT auch verwendet, um die Schrittgröße für die Schwellenwertkombinationen festzulegen. Das heißt, FT = 0,1 wählt auch Schwellenwerte für die 10%, 20%, … und 100% der Pixel mit dem höchsten Signal. Wenn FT nicht gleichmäßig durch 100 teilbar ist, dann ist der verbleibende Prozentsatz die letzte Schrittgröße. Für Metriken, die keinen Schwellenwert benötigen (d. h. PCC, SRCC und ICQ), werden die Werte unter der Annahme berechnet, dass nur die Pixel oberhalb der Schwellenwerte existieren. Das Fenster „Metrikmatrix“ bietet Optionen zum Speichern der Ergebnisse als Text oder Bild, zum Ändern des FT oder des Typs der Metrik, zum Anzeigen der Metrikwerte einzelner Zellen als Liste und zum Berechnen des Mittelwerts, Medians oder Modus der Metrik für jede Schwellenwertkombination. Mit den Schaltflächen „Proc“ (verarbeitet) und „Raw“ (roh) wird festgelegt, ob es sich bei der Liste der angezeigten, kopierten oder mit den Schaltflächen „List“, „Copy“ oder „Save…“ gespeicherten Daten um den Durchschnittswert für die Probe für jede Schwellenwertkombination (z. B. Medianwert) oder um alle Werte für jede Zelle in der Probe für alle Schwellenwertkombinationen handelt.

Analysis

Die Registerkarte „Analysis“ verfügt über drei Unterregisterkarten („Analysis Metrics“, „Metrics Info“ und „Custom“). Die Unterregisterkarte „Analysis Metrics“ enthält sechs Metriken zur Messung der Kolokalisierung für zwei Reporter (Abb. 4A) und drei Metriken für drei Reporter (siehe vorheriger Abschnitt). Die Benutzer können einen Schwellenwert oder keinen Schwellenwert für PCC, SRCC und ICQ wählen. Die Kolokalisationskoeffizienten von TOS und Manders müssen einen Schwellenwert haben, um berechnet zu werden. Die Unterregisterkarte Metrics Info enthält Informationen und Ressourcen zu den Metriken, die in der Unterregisterkarte Analysis Metrics verwendet werden (weitere Einzelheiten in den Ergänzenden Informationen). Schwellenwerte können nach der Methode von Costes30 oder manuell ausgewählt werden. Auf der Unterregisterkarte „Benutzerdefiniert“ (weitere Informationen finden Sie in den Ergänzenden Informationen) können die Benutzer ihren eigenen Code in JavaTM schreiben, um Bilder zu analysieren (Hinweis: Das angegebene Beispiel dient der Berechnung der PCC) (Abb. 4B). Die Schaltfläche „Kompilieren“ testet den Code, erstellt eine temporäre Datei im temporären Java-Verzeichnis und zeigt das Ergebnis der Kompilierung mit dem Hinweis „Erfolgreich“ oder „Fehlgeschlagen“ an. Bei Erfolg wird der kompilierte benutzerdefinierte Code erneut in den Speicher eingelesen und auf die ausgewählten Zellen angewandt.

Die Ausgabe jeder Analyse ist eine Tabelle, die das Bild und eine Identifikationsnummer für jede Zelle angibt (Abb. 4C), und für jede Zelle werden Werte angegeben für: (i) die ausgewählte Metrik, (ii) die physikalischen Parameter und (iii) die durchschnittliche Signalintensität für jeden Kanal (falls ausgewählt). Hinweis: „NaN“ in der Ausgabetabelle zeigt an, dass ein Wert nicht berechnet werden konnte. Der Benutzer kann auch zusammenfassende Fenster (mit der Zellzahl, dem Mittelwert, dem Median und der Standardabweichung für die ausgewählte Metrik) (Abb. 4D), Histogramme der Metrikwerte (Abb. 4E), binäre Maskenbilder und eine Liste von ROIs erstellen, die die Position und Nummer jeder Zelle auf jedem Bild im ROI-Manager darstellen. ROI-Listen und binäre Maskenbilder können für eine erneute Analyse derselben Zellen gespeichert werden.

Anwendungen von EzColocalization

EzColocalization ist so konzipiert, dass es auf modulare Weise verwendet werden kann, um die Anpassung von Analysen für eine Vielzahl von Experimenten und Forscheranforderungen zu erleichtern. Dieser Abschnitt konzentriert sich auf die Demonstration spezifischer Werkzeuge in EzColocalization, um reale Probleme in verschiedenen Bildsätzen zu lösen.

In der ersten Anwendung von EzColocalization werden Bilder von Hippocampus-Neuronen der Ratte aus der Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, die Dieter Brandner und Ginger Withers zugeschrieben werden) verwendet, um zu demonstrieren: (i) die Verwendung eines Reporter-Kanals zur Zellidentifizierung, wenn ein Experiment keine separaten Nicht-Reporter-Bilder zur Zellidentifizierung hat; (ii) Zellfilter zur Auswahl von Zellen; und (iii) Visualisierungswerkzeuge zur Auswahl von Metriken. Der Arbeitsablauf der Analyse ist in Abb. 5A skizziert. Im ersten Schritt wurden zwei Reporterbildstapel erstellt: ein Stapel mit Bildern, auf denen F-Actin markiert ist (mit einem Phalloidin-Peptid, das mit Rhodamin konjugiert ist), und der zweite Stapel mit Bildern, auf denen Tubulin markiert ist (mit einem Antikörper, der mit Alexa 488 konjugiert ist) (Abb. 5B). Die Interaktion von F-Actin und Tubulin ist wichtig für das Wachstum und die Migration von Neuronen31,32. Wir verwendeten die F-Actin-Bilder zur Zellidentifizierung, da es in allen Zellen vorhanden ist und die Zellgrenzen anzeigt8. Einzelne Zellen wurden aus den F-Actin-Bildern ausgewählt, indem ein Schwellenwert zur Identifizierung von Zellen24 und ein Zellfilter zur Entfernung von Zelltrümmern angewendet wurden (Hinweis: Parameterwerte in Abb. 5A).

Nach der Auswahl der Zellen wurde die Intensität der Reportersignale anhand von zellulären Heatmaps und Streudiagrammen untersucht. Wir stellten fest, dass die Reporter bei hohen Signalstärken nicht kolokalisierten und dass es eine komplexe Beziehung zwischen den Signalintensitäten gab (Abb. 5C,D). Aus diesem Grund wurde die Lokalisierung mit Hilfe von Manders M1 und M2 und TOS quantifiziert (siehe ergänzende Informationen). M1 und M2 wurden an Schwellenwerten bewertet, die nach der Costes-Methode für die in Abb. 5B dargestellte Zelle ausgewählt wurden, und die Werte betrugen 0,289 bzw. 0,995. Diese Werte werden in der Regel so interpretiert, dass Tubulin eine starke Kolokalisierung mit F-Aktin und F-Aktin eine geringe Kolokalisierung mit Tubulin aufweist. Die TOS-Werte wurden durch die Erstellung einer metrischen Matrix mit den mittleren TOS-Werten bewertet. Die Matrix zeigte Kolokalisierung, Anti-Kolokalisierung und Nicht-Kolokalisierung bei verschiedenen Schwellenwerten für die Signalintensitäten von Tubulin und F-Actin (Abb. 5E). An Stellen in Zellen, an denen F-Actin und Tubulin die höchste Signalintensität aufweisen (oberste 10 % der Pixel für jeden Kanal), beträgt der mittlere TOS-Wert -0,36 (n = 20). Dieser negative Wert deutet auf eine Antilokalisierung hin, was mit dem Eindruck übereinstimmt, der sich aus den Heatmaps und Streudiagrammen ergibt, sowie mit anderen Berichten8.

In der zweiten Anwendung wurden Bilder von Saccharomyces cerevisiae, die eine Mitose durchlaufen, aus der Cell Image Library33 bezogen, um zu demonstrieren: (i) Zellidentifizierung durch handgezeichnete Umrisse (für Experimente, bei denen automatische Methoden der Zellidentifizierung nicht angewandt werden können); und (ii) Bildausrichtung. Bei den Reporter-Inputs handelte es sich um ein Bild von einem Wildtyp-Stamm („Kontrolle“; CIL: 13871), der das BFA1-Protein besitzt, das TEM1 auf den Spindelpolkörper lädt, und ein Bild von einem Stamm ohne das BFA1-Protein (∆bfa1-Deletionsmutante; CIL: 13870). In diesen Reporterbildern exprimieren die Zellen das mit GFP fusionierte TEM1-Protein, und die DNA wurde mit DAPI (4′, 6-Diamidino-2-Phenylindol) markiert. TEM1 lokalisiert sich während der Mitose an den Spindelpolkörpern und ist an der Auslösung des Ausstiegs aus der Mitose beteiligt33. Der Arbeitsablauf ist in Abb. 6A dargestellt. In dieser Anwendung wurden ROIs manuell mit dem „Freihand“-Auswahlwerkzeug in ImageJ auf DIC-Bildern um die Zellen gezogen. Binäre Masken, die zur Auswahl von Zellbereichen verwendet wurden, wurden durch Auswahl der ROIs und Verwendung der Funktionen „Clear Outside“ und „Auto Threshold“ von ImageJ24 erstellt (Abb. 6B). Die Zellbereiche wurden zur Zellidentifizierung und zur Korrektur der Ausrichtung zwischen den DIC-Bildern und den Reporterkanälen unter Verwendung des Schwellenwertalgorithmus „Standard“ verwendet (Abb. 6C). Nach dieser Zellidentifizierung und Bildausrichtung sind die Bilder nun bereit für die Visualisierung und Analyse, wie im vorherigen Beispiel beschrieben.

In der dritten Anwendung wurden Bilder ganzer adulter Caenorhabditis elegans aus der Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 verwendet, um zu zeigen, dass: (i) EzColocalization die Kolokalisierung in ganzen Organismen analysieren kann und (ii) „Zell“-Filter einzelne Organismen anhand der Reportersignalintensität auswählen können. Die Bilder in diesem Beispiel stammen aus demselben Datensatz, der in unserer Studie zur Beschreibung von TOS verwendet wurde (es handelt sich jedoch nicht um dieselben Bilder)8. Der Arbeitsablauf ist in Abb. 7A dargestellt. Umrisse einzelner C. elegans wurden in ImageJ auf Hellfeldbildern gezeichnet, um ROIs zu erstellen, und die ROIs wurden dem ROI-Manager zur „Zell“-Identifizierung hinzugefügt. GFP, das vom clec-60-Promotor im vorderen Darm exprimiert wird, war Reporter 1 und mCherry, das vom myo-2-Promotor im Pharynx exprimiert wird, der ein Organ neben dem vorderen Darm ist35, war Reporter 2. Zellfilter für physikalische Parameter waren nicht notwendig, da nur die Objekte, die als C. elegans geeignet waren, von vornherein umrissen wurden. Zellfilter für die Signalintensität waren jedoch notwendig, da einige C. elegans ein geringes GFP-Signal aufwiesen, was möglicherweise auf das Silencing von Transgenen zurückzuführen war36,37 (Abb. 7B). Die anschließende Visualisierung und Analyse kann wie in der ersten Anwendung beschrieben durchgeführt werden.

In der vierten Anwendung demonstrieren wir die Analyse der Kolokalisierung für drei Reporterkanäle. Der Arbeitsablauf war derselbe wie für zwei Reporterkanäle, außer dass im Hauptmenü „Einstellungen“ zunächst „3 Reporterkanäle“ ausgewählt wurde (Abb. 8A). Die Bilder stammen aus der Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Version 1, Image set: 37983, image: p23_s9) von U2OS-Knochenkrebszellen (n = 66)38. Bei den drei Reporterbildern wurden DNA, endoplasmatisches Retikulum (ER) und Mitochondrien jeweils mit Hoechst 33342, Concanavalin A/Alexa Fluor488-Konjugat und MitoTracker Deep Red gefärbt (obere Reihe, Abb. 8B). Die Identifizierung der Zellen erfolgte mit einem Bild der Plasmamembran, die mit Weizenkeimagglutinin (WGA)/Alexa Fluor 555-Konjugat markiert war (oben links, Abb. 8B). Hinweis: Auf dem Bild waren auch der Golgi-Apparat und das F-Actin-Netzwerk markiert38. Die Plasmamembran wurde mit dem Polygonauswahlwerkzeug in ImageJ nachgezeichnet, um ROIs für die einzelnen Zellen zu erstellen, und der ROI-Manager, der die ROIs enthielt, wurde für die Zellidentifizierung ausgewählt.

Die Lokalisierungsmuster wurden auf die gleiche Weise wie bei zwei Reportern visualisiert, mit der Ausnahme, dass: (i) es gibt drei Sätze von Heatmaps für die Reporter anstelle von zwei (untere Reihe, Abb. 8B); und (ii) Scatterplots und metrische Matrizen sind dreidimensional (Abb. 8C-F). Auf der Registerkarte Visualisierung und der Registerkarte Analyse (Abb. 8G) besteht die Möglichkeit, die Kolokalisierung für die drei Reporter mit den Metriken ICQ, TOS oder M1, M2 und M3 von Manders zu messen. Von den drei Metriken war TOS am einfachsten zu interpretieren. TOS hat einen einzigen Wert zur Messung der Kolokalisierung aller drei Reportersignale und zeigte deutlich, dass sich die Reportersignale für den Zellkern, die Mitochondrien und das ER bei niedrigen Schwellenwerten überlappen (d. h. bei hohen FT-Werten gibt es eine Kolokalisierung; rote Farbe in Abb. 8E) und bei hohen Schwellenwerten nicht überlappen (d. h. bei niedrigen FT-Werten gibt es eine Antikolokalisierung; blaue Farbe in Abb. 8E). Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit der Überlappung von Zellkern, Mitochondrien und ER-Organellen an ihren Rändern (wo das Signal ihrer Reporter typischerweise geringer ist) aufgrund bekannter physikalischer Wechselwirkungen, aber nicht in ihren Zentren (wo das Signal ihrer Reporter typischerweise höher ist), da sie unterschiedliche Strukturen in Zellen sind39,40,41.