Evolutionsanalyse des gyrA-Gens von Neisseria meningitidis-Bakterienstämmen des klonalen Komplexes 4821, die zwischen 1978 und 2016 in China gesammelt wurden

Evolutionsanalyse von 77 gyrA-Nukleotidsequenzen aus CC4821 N.meningitidis-Stämmen

Siebenundsiebzig de novo gyrA-Sequenzen von CC4821 N.meningitidis wurden im Kontext von 149 öffentlich verfügbaren gyrA-Sequenzen analysiert (aufgelistet in Zusatztabelle 1). Mit dem resultierenden Datensatz von 226 gyrA-Nukleotidsequenzen wurde ein phylogenetischer Baum mit Nachbarschaftsbeziehungen erstellt (Abb. 1). Ein ähnlicher Baum wurde mit der Maximum-Likelihood-Methode (ML) erstellt (Zusätzliche Abbildung 1). Die Nukleotidsequenzen wichen mit einer p-Distanz von 0,045 signifikant voneinander ab (Tabelle 1). Ein Überblick über den Baum zeigte, dass die Sequenzen von CC4821 N.meningitidis-Stämmen (in rot in Abb. 1) im gesamten Baum zu finden waren, was zeigt, dass das gyrA-Gen innerhalb dieser Stämme relativ divergent war.

Nachbarn verbinden phylogenetischen Baum von 226 gyrA-Gen-Sequenzen von Neisseria-Stämmen. Der Name des Stammes ist wie folgt angegeben: Artname-GB-ID-Stamm-ID-ST-CC-Serogruppe-Sammlungsland-Sammlungsjahr-CIP-Resistenzphänotyp. Fehlende Informationen werden durch ein leeres Feld angezeigt. Zum Beispiel: N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Deutschland-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Südkorea-2017. Die Sequenznamen von CC4821 N.meningitidis-Stämmen sind in roter Schrift angegeben. Die 77 in dieser Studie generierten Sequenzen sind unterstrichen. Die Sequenzen von 9 Referenzstämmen sind durch einen schwarzen Punkt gekennzeichnet. Bootstrap-Werte > 70% sind angegeben. Bootstrap-Werte < 70% sind in Klammern angegeben, wenn dies erforderlich ist. Die 9 genetischen Gruppen, die in dieser Studie identifiziert wurden, sind als eingeklammerte vertikale Linien dargestellt. Der CIP-Resistenz-Phänotyp wird mit R für Resistenz, S für empfindlich und I für intermediären Resistenz-Phänotyp angegeben

Unter den 226 analysierten Sequenzen wurden fast 62 % der Sequenzen (140) an der Spitze des Baumes gefunden, ohne signifikanten Bootstrap-Wert (Abb. 1). Diese Sequenzen waren sehr homogen, mit einem p-Abstand von 0,003 (Tabelle 1). Die übrigen 86 Sequenzen waren mit einem p-Abstand von 0,066 im Vergleich zu den Sequenzen an der Spitze des Baumes stärker divergent. Die meisten der diese 86 Sequenzen betreffenden Knoten wiesen einen Bootstrap-Wert > 70% auf. Darüber hinaus betrug der p-Abstand innerhalb dieser Gruppe von 86 Sequenzen 0,09, was zeigt, dass diese Sequenzen untereinander stark divergieren. Da die Hauptknoten des Baums einen Bootstrap-Wert > 80% aufwiesen, beschlossen wir, die Sequenzen willkürlich 9 verschiedenen genetischen Gruppen zuzuordnen (Abb. 1; Tabelle 1). Diese 9 Gruppen wurden auch im ML-Baum gefunden (Zusätzliche Abbildung 1). Die gyrA-Sequenzen von CC4821-Stämmen wurden in 6 dieser genetischen Gruppen gefunden, nämlich in Gruppe 1, 2, 3, 5, 6 und 8.

Gruppe 1 bestand aus zwei Sequenzen, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 und N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Diese Gruppe wurde durch einen Bootstrap von 100 % unterstützt, was darauf hindeutet, dass sich diese beiden Sequenzen stark vom Rest der Sequenzen unterscheiden. Die Sequenzen teilten 7 Aminoänderungen (Tabelle 1, zusätzliche Tabelle 2). Der lange Zweig, der der Sequenz N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 entspricht, deutet jedoch darauf hin, dass diese Sequenz auch signifikant von N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 abweicht, was durch einen p-Abstand von 0,06 zwischen diesen beiden Sequenzen bestätigt wurde (Tabelle 1).

Gruppe 2 bestand aus zwei Sequenzen von N.meningitidis-Stämmen, die 2007 und 2011 in den Provinzen Gansu und Guangxi in China gesammelt wurden, nämlich N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R und N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Gruppe 3 bestand aus einer einzigen Sequenz, nämlich N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Der dieser Sequenz entsprechende Knoten wurde durch einen Bootstrap-Wert von 80 % unterstützt. Darüber hinaus betrug der niedrigste paarweise p-Abstand zwischen dieser Sequenz und den anderen analysierten Sequenzen 0,032, was zeigt, dass diese Sequenz im Vergleich zum Rest der analysierten Sequenzen signifikant divergent war (Tabelle 1).

Gruppe 5 bestand aus 26 Sequenzen, hauptsächlich von N. meningitidis, darunter 9 von CC4821. Eine Untergruppe von 7 Sequenzen, die durch einen Bootstrap von 100% unterstützt wurde, enthielt 5 Sequenzen von N.lactamica. Interessanterweise bildete N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 ein Cluster mit N.lactamica-Sequenzen mit einem Bootstrap von 100 % und einem langen Zweig.

Gruppe 6 bestand aus 27 Sequenzen von N.meningitidis (8 von CC4821) und 1 Sequenz von N. cinerea, nämlich N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, die einen Knoten mit N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R teilte. Die N.cinerea-Sequenz wies jedoch einen langen Zweig auf, was auf eine erhebliche Divergenz im Vergleich zur N.meningitidis-Sequenz hindeutet. Ausgehend von den verfügbaren Daten schienen die Sequenzen der Gruppe 6 von Stämmen zu stammen, die gegen CIP resistent waren. Diese Stämme wiesen jedoch keine eindeutige Aminosäuresubstitution auf, was darauf schließen lässt, dass es keinen gemeinsamen Marker für den Resistenzphänotyp dieser Stämme gibt (Zusätzliche Tabelle 2).

Gruppe 8 enthielt die meisten der in diesem Bericht analysierten N.meningitidis-Sequenzen (64 %). Die Stämme wurden in den letzten 88 Jahren in 13 verschiedenen Ländern auf 4 Kontinenten gesammelt. Trotz der großen Zeitspanne und der geografischen Streuung waren diese Sequenzen mit einer p-Distanz von 0,003 hoch konserviert. Außerdem stammten diese Sequenzen von Stämmen aus 68 STs, 24 CCs und 9 Serogruppen, einschließlich des Referenzstammes 053442. Insgesamt zeigten diese Beobachtungen, dass das GyrA-Gen bei den meisten N.meningitidis-Stämmen trotz unterschiedlicher genetischer Merkmale, geografischer Standorte oder Sammelzeiten hoch konserviert war.

Analyse der Divergenz innerhalb des GyrA-Proteins

Die Aminosäuredivergenz innerhalb des GyrA-Proteins wurde anhand von 129 einzigartigen Sequenzen analysiert (Zusätzliche Tabelle 2). Unter den 931 Aminosäuren im Alignment wurden 27 divergente Positionen identifiziert (Abb. 2). Obwohl diese Stellen über das gesamte Protein verteilt waren, schien die Verteilung der Divergenz nicht zufällig zu sein. In der Tat waren zwei Regionen hoch konserviert, von Position 530 bis 620 und eine kleinere Region zwischen 300 und 330. Dem E.coli-Protein zufolge entspricht die erste Region dem Ende der aminoterminalen Domäne und dem Beginn der carboxyterminalen Domäne. Die zweite Region entspricht der Turmdomäne des Proteins nach der 3D-Modellstruktur (Abb. 2).

Aminosäuredivergenz des GyrA-Proteins basierend auf 129 einzigartigen Sequenzen. Die Positionen innerhalb des 932 Aminosäuren langen Alignments sind auf der X-Achse angegeben. Der prozentuale Anteil der Sequenzen, die eine bestimmte abweichende Position aufweisen, ist auf der Y-Achse (linke Seite) angegeben. Zum Beispiel weisen 58 % der Sequenzen eine Mutation an Position 91 auf. Das Divergenzdiagramm wurde anhand der Aminosäuredifferenztabelle in der zusätzlichen Tabelle 2 erstellt. Das Alignment weist 10 Lücken auf, und die Anzahl der Sequenzen mit Lücken ist auf der rechten Achse als schwarzes Quadrat dargestellt. Eine Karte des E.coli GyrA-Proteins mit den strukturellen und funktionellen Domänen ist unten zum Vergleich dargestellt. Die Karte wurde auf der Grundlage der folgenden Referenzen erstellt. Die GyrA-Proteinsequenz von E.coli und dem N.meningitidis-Referenzstamm 053442 (GB-ID CP000381) wurde verglichen (Zusätzliche Tabelle 4). Die bekannten CIP-resistenten Stellen in E.coli sind dargestellt und die entsprechenden Positionen in N.meningitidis sind mit einer blauen Linie gekennzeichnet. Es ist erwähnenswert, dass von den 8 in E.coli gemeldeten resistenten Stellen nur die Positionen 83 und 87 in N.meningitidis divergieren (Stellen 91 und 95)

Unter den 257 divergierenden Positionen gab es keine, die von allen analysierten gyrA-Sequenzen der CC4821-Stämme geteilt wurden. Fünf Stellen (91, 417, 665, 210 und 288) waren stark divergent, 40% oder mehr der 129 Sequenzen waren an diesen Stellen mutiert. Zum Beispiel wiesen 48 % der 129 Sequenzen einen mutierten Rest an Position 417 auf (Abb. 2). Eine Position (91) schien mit der CIP-Resistenz in Verbindung zu stehen, da alle Stämme, die nicht empfindlich auf CIP reagierten, an dieser Position mutiert waren und entweder ein I, ein F oder ein V aufwiesen (Zusätzliche Tabelle 2).

Identifizierung potenzieller Resistenzmarker gegen CIP

Unter den 226 analysierten Sequenzen stammten 174 von Stämmen, die auf ihre Resistenz gegen CIP getestet wurden (Zusätzliche Tabelle 1). Siebenundsechzig Stämme wurden für diese Studie getestet. Wie bereits erwähnt, waren alle Stämme, die nicht empfindlich auf CIP reagierten (entweder mit einem resistenten Phänotyp (R im Baum) oder einem intermediären Phänotyp (I im Baum)), an Position 91 mutiert. Dies zeigte, dass eine Mutation an Position 91 mit dem Resistenzmechanismus verbunden war. Von den 67 in dieser Studie getesteten Stämmen waren 49 an Position 91 mutiert, aber 23 dieser Stämme wiesen einen intermediären Resistenzphänotyp auf. Dies deutet darauf hin, dass andere Positionen in den Resistenzmechanismus involviert sein könnten. Um weitere potenzielle Marker für die Resistenz zu ermitteln, wurden die 226 Stämme an jeder mutierten Position weiter analysiert. Eine Veränderung, die in resistenten Stämmen (einschließlich eines intermediären Resistenzphänotyps), aber nicht in empfindlichen Stämmen zu finden ist, käme in Frage. Um die Stringenz der Analyse zu erhöhen, wurde eine Mutation, die in nur einem Stamm gefunden wurde, nicht berücksichtigt. Insgesamt wurden 33 Stellen identifiziert (Zusätzliche Tabelle 3; linke Seite der Zusätzlichen Tabelle 4). Beispielsweise wurde H8N in 18 resistenten Stämmen gefunden (darunter 2 mit intermediärem Phänotyp), aber in keinem der empfindlichen Stämme. Alle 226 Stämme wurden auf diese 33 Positionen hin analysiert. Um die Stringenz der Analyse zu erhöhen, wurde auch hier eine Mutation, die in mindestens einem empfindlichen Stamm gefunden wurde, aussortiert. So wurde die Mutation D95N, die in resistenten und empfindlichen Stämmen gefunden wurde, nicht weiter berücksichtigt. Insgesamt wurden 39 Mutationen (einige an derselben Position wie Position 91) analysiert (in Grün auf der linken Seite der zusätzlichen Tabelle 4). Für die 128 Stämme, die mindestens eine Mutation von Interesse aufwiesen, wurde ein Mutationsprofil erstellt (Zusätzliche Tabelle 3). Es wurden 46 verschiedene Profile identifiziert, was bedeutet, dass es 46 Kombinationen dieser 39 Mutationen unter allen analysierten Stämmen gab (rechte Seite der zusätzlichen Tabelle 4). Sechzehn der 46 Mutationsprofile betrafen CC4821-Stämme (rote Zahlen in der zusätzlichen Tabelle 4). Sechsundzwanzig Profile betrafen Stämme, die bekanntermaßen CIP-resistent sind (Stammnamen in blauer Schrift in zusätzlicher Tabelle 4). Unter den 39 potenziell resistenten Markern waren die Mutationen N103D und T91I mit 29 bzw. 27 Vorkommen in den Profilen am häufigsten vertreten. Es ist jedoch erwähnenswert, dass auch andere Mutationen wie H8N, I111V, E793Q und A679S mit 23, 21, 18 bzw. 17 Vorkommen gut vertreten waren. Erwähnenswert ist auch, dass 45 % der resistenten Stämme (58 von 128) nur die Mutation T91I aufwiesen. Da die Resistenzmarker ursprünglich in E.coli beschrieben wurden, war ein Vergleich zwischen den gyrA-Sequenzen von E.coli und dem Referenzstamm N.meningitidis 53.442 erforderlich, um die Position dieser Marker in der E.coli-Sequenz zu überprüfen (Zusätzliche Tabelle 5).

Rekombination innerhalb des gyrA-Gens zwischen N. spp.

Die phylogenetische Analyse identifizierte potenzielle Rekombinanten. Von besonderem Interesse war zum Beispiel die Gruppe 1, die N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 und N.subflava-CP031251.1-M18660 betrifft. Diese beiden Sequenzen wiesen 7 Änderungen auf, die in anderen Stämmen nicht vorkommen. Außerdem lagen 5 dieser Änderungen innerhalb von 30 Aminosäuren (Tabelle 1). Schließlich gab es Aminosäureveränderungen, die bei einem Stamm beobachtet wurden, bei dem anderen Stamm jedoch nicht, z. B. an den Positionen 740 und 750. All diese Beobachtungen deuten auf eine Rekombination zwischen diesen beiden Stämmen hin, was durch eine BootScan-Analyse bestätigt wurde (Abb. 3a). Drei weitere mögliche Rekombinationen wurden durch BootScan bestätigt. Abb. 3b beschreibt eine Rekombination zwischen einem CC4821-Stamm (wahrscheinlich entweder N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 oder N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) und N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. Abb. 3c zeigt mehrere Rekombinationen zwischen N.lactamica-CP031253.1-M17106—– und zwei N.meningitidis-Stämmen, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– und N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. In Abb. 3d ist schließlich eine Rekombination zwischen N.meningitidis-Stämmen zu sehen. Insgesamt zeigte die Rekombinationsanalyse, dass das gyrA-Gen von Neisseria-Stämmen sehr anfällig für Rekombination ist.

Potenzielle Rekombinationsereignisse zwischen und innerhalb von Neisseria-Stämmen. a. Rekombination zwischen N.subflava und N.meningitidis. Ein BootScan-Plot wurde in SimPlot mit N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 als Abfrage erstellt. b. Rekombination zwischen N.cinerea und N.meningitidis. Ein BootScan-Plot wurde in SimPlot mit N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R als Abfrage erstellt. c. Rekombination zwischen N.lactamica und N.meningitidis. Ein BootScan-Plot wurde in SimPlot mit N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 als Abfrage erstellt. d. Rekombination zwischen N.meningitidis-Stämmen. Ein BootScan-Plot wurde in SimPlot mit N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 als Abfrage erstellt. Der Stamm, von dem vorhergesagt wird, dass er am meisten zum Rekombinationsprozess beiträgt (Backbone), ist als rote Linie dargestellt. Der N.meningitidis-Referenzstamm 053442 (GB ID CP000381) ist als schwarze Linie dargestellt. Oben ist eine Funktionskarte für den Referenzstamm 053442 dargestellt, die auf der in Abb. 2 gezeigten E.coli-Funktionskarte basiert